वर्तमान प्रोटोकॉल चावल की शूटिंग के लिए एक समाशोधन तकनीक का वर्णन करता है, जो ऊतकों की कठोर, मोटी या स्तरित प्रकृति के कारण आंतरिक संरचनात्मक टिप्पणियों के लिए तैयार करना मुश्किल है। यह विधि वयस्क चावल के पौधों में भी निरंतर और गहरी प्रतिदीप्ति टिप्पणियों की सुविधा प्रदान करती है।
हाल ही में विकसित समाशोधन तकनीक जो अपवर्तक सूचकांक बेमेल को समाप्त करती है और ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को कम करती है, ने अपनी आंतरिक संरचनाओं को संरक्षित करते हुए तीन आयामों (3 डी) में पौधों के ऊतकों का निरीक्षण करना संभव बना दिया है। चावल (ओरिज़ा सैटिवा एल), एक मोनोकोट मॉडल प्लांट और विश्व स्तर पर महत्वपूर्ण फसल में, उन अंगों में समाशोधन तकनीक की सूचना दी गई है जो अपेक्षाकृत आसान हैं, जैसे कि जड़ें और पत्तियां। शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) और उपजी में समाशोधन तकनीक के अनुप्रयोगों की भी सूचना दी गई है, लेकिन इन ऊतकों में समाशोधन समाधान (सीएस) के खराब प्रवेश के कारण केवल सीमित डिग्री तक। इन ऊतकों में समाशोधन समाधानों की सीमित दक्षता को स्टेम में ऊतकों के ऑटो-प्रतिदीप्ति, मोटा होना और सख्त होने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है क्योंकि संवहनी बंडल और एपिडर्मिस पानी-विकर्षक पत्तियों के साथ एसएएम के विकास और लेयरिंग के रूप में जिम्मेदार ठहराया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल विकास के दौरान शूटिंग के आधार पर एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ से जीन अभिव्यक्ति के निरंतर और 3 डी अवलोकन के लिए एक समाशोधन दृष्टिकोण के अनुकूलन की रिपोर्ट करता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले फिक्स्ड ऊतक के नमूनों को एक कंपन माइक्रो-स्लाइसर का उपयोग करके वर्गों में छंटनी की गई थी। जब एक उपयुक्त मोटाई हासिल की गई थी, तो सीएस लागू किया गया था। विशेष रूप से केंद्रीय ऊतक को लक्षित करके, सीएस की प्रवेश दर और एकरूपता में वृद्धि हुई, और ऊतक को पारदर्शी बनाने के लिए आवश्यक समय कम हो गया। इसके अतिरिक्त, छंटनी किए गए वर्गों के समाशोधन ने मैक्रो परिप्रेक्ष्य से पूरे शूट की आंतरिक संरचना के अवलोकन को सक्षम किया। इस पद्धति में अन्य पौधों की प्रजातियों के ऊतकों की गहरी इमेजिंग में संभावित अनुप्रयोग हैं जिन्हें साफ़ करना मुश्किल है।
हाल ही में विकसित समाशोधन तकनीक ने पौधों की आंतरिक संरचना 1,2,3 को संरक्षित करते हुए उनके गहरे ऊतकों का निरीक्षण करना संभव बना दिया है। डायकोट मॉडल प्लांट अरबिडोप्सिस में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग पर कई अध्ययन अपवर्तक सूचकांक बेमेल को खत्म करने और ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री 4,5,6 को हटानेके लिए समाशोधन तकनीक का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं। यद्यपि सेलुलर रिज़ॉल्यूशन9 पर समाशोधन तकनीक 7,8 और 3 डी इमेजिंग का उपयोग चावल (ओरिज़ा सैटिवा एल), एक मोनोकोट मॉडल प्लांट और विश्व स्तर पर महत्वपूर्ण फसल में बताया गया है, ये अपेक्षाकृत पतले और नरम अंगों तक सीमित हैं, जैसे जड़ें, पत्तियां, और शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम), जिन्हें निरीक्षण करना आसान है।
शूट संवहनी पौधों के उपरोक्त भागों का गठन करने वाला मुख्य अंग है। चावल में, शूट लंबवत स्टैक्ड “फाइटोमर्स” की एक श्रृंखला से बने होते हैं, जिसमें एक्सिलरी कलियां, पत्तियां और स्टेम10 शामिल होते हैं। शूट की नोक पर, एसएएम केंद्र में उदासीन स्टेम कोशिकाओं से बना है। फाइटोमर्स एसएएम से प्राप्त कोशिकाओं के भेदभाव से बनते हैं। पौधों को वनस्पति से प्रजनन चरण में स्थानांतरित करने के बाद, चावल के तने लम्बे हो जाते हैं और एसएएम युवा पुष्पगुच्छ10 में अंतर करता है। यह विकासात्मक परिवर्तन उपजी और एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ में विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति में उतार-चढ़ाव के साथ होता है। विभिन्न ऊतकों में सेल भेदभाव अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, आंतरिक शूट ऊतकों में सेल आकृति विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति का संरचनात्मक रूप से निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, शूट में उपजी (नोड्स और इंटर्नोड्स) की गहरी इमेजिंग ऊतक में प्रवेश करने के लिए समाशोधन समाधान की अक्षमता के कारण एक चुनौती प्रस्तुत करती है। स्टेम तुरंत एसएएम से भेदभाव के बाद पार्श्व विकास से तेजी से मात्रा में वृद्धि से गुजरते हैं। संवहनी बंडलों के मोटा होने और नोडल संवहनी एनास्टोमोसिस के क्षैतिज जटिल लिंक के कारण चावल नोड ऊतकों का सख्त होना, चावल की शूटिंग की उच्च पुनरावृत्ति के अलावा, सभी उपजी10 में सीएस के प्रवेश को सीमित करने में योगदान करते हैं।
इस अध्ययन का उद्देश्य संरचनात्मक गहरी प्रतिदीप्ति तकनीक का उपयोग करके चावल शूट ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का निरीक्षण करना था। यह काम चावल के लिए एक समाशोधन प्रोटोकॉल का अनुकूलन करता है ताकि एसएएम / युवा पुष्पगुच्छ से 3 डी संरचना में आधार तक जीन अभिव्यक्ति का लगातार निरीक्षण किया जा सके, बजाय एक सपाट सतह पर, एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके।
प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निर्धारण और ट्रिमिंग हैं। चावल की शूटिंग में कठोर, मोटे या स्तरित ऊतक होते हैं जो फिक्सेटिव समाधान के प्रवेश को सीमित करते हैं। फिक्सेटिव समाधान की पारगम्यता में सुधार करने के लिए, ऊतक के एक तरफ नमूने पर पतली मुंडा किया गया था, जैसा कि चित्रा 1 ई-एफ में दिखाया गया है। इसके अलावा, वैक्यूम उपचार को उच्च दबाव का उपयोग करके दो बार दोहराया गया था। इसके अलावा, नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य 2 घंटे निर्धारण के बजाय 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर तय किए गए थे।
ट्रिमिंग चरण में मुख्य बिंदु सीएस उपचार की एक छोटी अवधि के बाद अपनी आंतरिक संरचना को संरक्षित करते हुए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का निरीक्षण करने के लिए तैयार होने वाले ऊतकों की मोटाई निर्धारित करना है। जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, 1 मिमी मोटी नमूने, जितना संभव हो उतना पतला हाथ से छंटनी की गई, सीएस उपचार के 3 महीने बाद भी केवल सीमित संख्या में ऊतकों में पारदर्शी हो गई। इसलिए, वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे प्रतिदीप्ति अवलोकन के लिए ट्रिमिंग चरण आवश्यक है। इस अध्ययन में, नमूनों को 130 μm की मोटाई तक छंटनी की गई थी, जैसा कि चित्रा 2 डी में दिखाया गया है। 130 μm मोटाई सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद पत्तियों को साफ करने के लिए अनुमति दी और 2 सप्ताह के बाद पूरे नमूने. इस अध्ययन में 9-10 एलएस पर वयस्क चावल की शूटिंग का उपयोग किया गया था। छोटे चावल की शूटिंग से मोटी लेकिन नरम ऊतकों को सीएस उपचार के साथ तेजी से साफ किया जा सकता है। नमूनों की मोटाई और सीएस उपचार की अवधि को ऊतक प्रकार, स्थिति और 3 डी संरचना की मोटाई के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।
संशोधन और समस्या निवारण विधियाँ
सीएस कम तापमान पर आसानी से अवक्षेपित हो जाता है। अवक्षेपित सीएस फ्लोरोसेंट प्रोटीन को संरक्षित नहीं कर सकता है; इसलिए, उचित तापमान पर नमूनों को संग्रहीत करते समय देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, सीएस और फिक्सेटिव समाधान दोनों का कोई एंटीसेप्टिक प्रभाव नहीं है; इसलिए, दूषित होने पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन अपमानित हो जाएगा। मिट्टी में उगाए गए चावल फंगल विकास के लिए प्रवण होते हैं; इसलिए, नमूनों के नमूने और हैंडलिंग संदूषण से बचने के लिए देखभाल के साथ किया जाना चाहिए।
बफर में अतिरिक्त फ्लोरोसेंट रंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति दे सकते हैं और सूक्ष्म टिप्पणियों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इवांस ब्लू डाई युक्त एक कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान का उपयोग पहले किया गया था। 1 घंटे के लिए धुंधला होने और 1 घंटे के लिए धोने के बाद, ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज के फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 555 एनएम लेजर का उपयोग करके देखा गया था। हालांकि, इवांस ब्लू डाई से प्राप्त पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के कारण फ्लोरोसेंट प्रोटीन नहीं देखा जा सका। इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति लगभग 2 घंटे के लिए नमूने धोने से समाप्त हो गया था। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्पष्ट थे अगर नमूने रात भर छोड़ दिए गए थे। इसलिए, इस अध्ययन में एक शुद्ध कैल्कोफ्लोर सफेद समाधान का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट डाई से व्युत्पन्न पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति टिप्पणियों से पहले विभिन्न लेजर तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर जाँच की जानी चाहिए।
विधि की सीमाएँ
जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद 130 μm मोटी नमूनों में गहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन देखी गई थी। यह चित्रा 2 डी में दिखाए गए परिणामों के अनुरूप है, जहां 130 μm मोटी नमूना सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद पारदर्शी हो गया। हालांकि, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, साइटोप्लाज्म का ऑटो-प्रतिदीप्ति अभी भी 2 सप्ताह के बाद नोड्स में ध्यान देने योग्य था और सीएस उपचार के 4 सप्ताह के बाद ही पूरी तरह से हटा दिया गया था। नोड्स में एक उच्च सेल घनत्व होता है और इसलिए, ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को हटाने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है।
जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, सीएस उपचार के बिना पत्तियों में गहरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन देखे गए थे, लेकिन चमक 20 μm की समान गहराई पर नोड्स और इंटर्नोड्स की तुलना में कमजोर थी। सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन उज्ज्वल थे। क्लोरोफिल पत्तियों में प्रचुर मात्रा में होता है और उत्तेजना प्रकाश के 488 एनएम को अवशोषित करता है। लाल ऑटो-प्रतिदीप्ति भी है, जो 555 एनएम लेजर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन में हस्तक्षेप कर सकता है। सीएस उपचार के 1 सप्ताह के बाद, क्लोरोफिल और अन्य ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्रियों को हटा दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात छवियां थीं।
सीएस उपचार के 2 सप्ताह और 4 सप्ताह के बाद ऊतकों में देखी जा सकने वाली गहराई काफी अलग नहीं थी, हालांकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन 4 सप्ताह (चित्रा 3) के बाद कमजोर दिखाई दिए। आम तौर पर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और ऑटो-फ्लोरेसेंस की चमक समय के साथ कमजोर हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सूक्ष्म स्थितियों और छवि प्रसंस्करण को समायोजित करके अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन परिणामों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला गया था कि सीएस उपचार के 2 सप्ताह हमारे नमूना स्थितियों को देखते हुए गहरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अवलोकन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, स्पष्ट छवियों का निरीक्षण करने के लिए 4 सप्ताह की आवश्यकता होती है जो ऑटो-फ्लोरोसेंट सामग्री को पूरी तरह से बाहर करते हैं।
मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस वाली संरचनाएं, जैसे संवहनी बंडल और बहु-बांह कोशिकाएं, सीएस में साफ नहीं की जा सकती हैं। ऑटोफ्लोरेसेंस के बिना इन संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए, एक समय-गेटिंग विधि12 का उपयोग करना या प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम की स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा छवियों को प्राप्त करना आवश्यक है। एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप गहरे ऊतकों को देखने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है यदि मोटे ऊतक देखे जाते हैं।
मौजूदा और वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
आम तौर पर, चावल के पौधों की आंतरिक संरचनाओं को क्रायोस्टैट या वाइब्रेटोम सेक्शनिंग का उपयोग करके देखा गया है। एक क्रायोस्टैट पतले वर्गों को तैयार करने के लिए उपयुक्त है, जो आसान अवलोकन की अनुमति देता है, लेकिन नमूनों की तैयारी और उपकरणों का संचालन समय लेने वाला है। पतले वर्गों से मूल 3 डी संरचना का पुनर्निर्माण करना भी मुश्किल है। वाइब्रेटोम संचालित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और मोटे वर्गों के उत्पादन के लिए उपयुक्त है। हालांकि, लक्ष्य ऊतकों के मोटे वर्ग केवल कट सतह की टिप्पणियों की अनुमति देते हैं और गहरे ऊतकों को नहीं जो प्रकाश तक नहीं पहुंच सकते हैं। इन कारणों से, गहरी प्रतिदीप्ति टिप्पणियों के लिए न तो विधि उपयुक्त है।
इस अध्ययन ने चावल की शूटिंग में गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन में चुनौतियों को संबोधित किया, जैसे कि सीएस के सीमित ऊतक प्रवेश और मौजूदा तरीकों के संयोजन से एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत खराब वस्तु संकल्प। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, हमने फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएसएमएडीएस 15-एमओआरंज) को युवा पुष्पगुच्छ से आधार तक वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे ऊतकों में व्यक्त किया। चित्रा 4 डी फ्लोरेट पर केंद्रित है और 3 μm अंतराल पर गहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन दिखाता है। सीएस उपचार के 2 सप्ताह के बाद -130 μm गहराई से अधिक ऊतकों को देखा गया था, लेकिन सीएस उपचार के बिना एक ही आकार और विकास चरण में फ्लोरेट में केवल -27 μm गहराई के भीतर के ऊतकों को देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया)। वर्तमान बेहतर प्रोटोकॉल ने न केवल जीन के ओवरएक्सप्रेशन के अवलोकन की अनुमति दी, बल्कि वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे ऊतकों में प्राकृतिक जीन अभिव्यक्ति भी की अनुमति दी।
विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
यह प्रोटोकॉल, जो वयस्क चावल की शूटिंग के गहरे प्रतिदीप्ति अवलोकन का अनुकूलन करता है, अनावश्यक ऊतकों को ट्रिम करके और सीएस की पारगम्यता को बढ़ाकर कठिन, मोटी या स्तरित ऊतकों के कुशल समाशोधन को सक्षम बनाता है। इसके अलावा, विश्लेषण के लिए नमूनों की मोटाई को एक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निरंतर और संरचनात्मक गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो आमतौर पर मोटी या अपारदर्शी ऊतकों को हल नहीं कर सकता है।
विभिन्न विकास चरणों में चावल के नमूनों की तुलना करना मुश्किल है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिक्सेटिव और पीबीएस समाधानों में समय के साथ नीचा दिखाते हैं। हालांकि, सीएस में फ्लोरोसेंट प्रोटीन को 5 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकताहै 1. सीएस का लंबा शेल्फ जीवन चावल में गहरी प्रतिदीप्ति अवलोकन के लिए एक बड़ा लाभ है।
हाल ही में, कई समाशोधन प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं, जिससे उनकी आंतरिक संरचनाओं को संरक्षित करते हुए 3 डी में गहरे ऊतकों का निरीक्षण करना संभव हो गया है। इन प्रौद्योगिकियों का विकास जारी है, और नए समाशोधन समाधान विकसित किए गए हैं। एक अच्छा उदाहरण iTOMEI14 है, जो कुशल क्लोरोफिल हटाने और उज्ज्वल प्रतिदीप्ति का पता लगाने में सक्षम बनाता है। एक अन्य उदाहरण क्लियरसीअल्फा15 है, जो समाशोधन उपचार के दौरान ऊतकों के ब्राउनिंग को रोकता है और उन्हें पारदर्शी दिखाई देता है। वर्तमान विधि के साथ इन समाशोधन समाधानों के संयोजन से अधिक कुशल और प्रभावी समाशोधन की अनुमति मिल सकती है।
यह उम्मीद की जाती है कि वर्तमान विधि न केवल चावल बल्कि अन्य पौधों की गहरी इमेजिंग के माध्यम से नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद करेगी।
The authors have nothing to disclose.
हम ओएसएमएडीएस 15-मोरेंज बीज प्रदान करने के लिए डॉ आर टेराडा, डॉ जेड शिमातानी और डॉ एच त्सुजी को धन्यवाद देते हैं; एनजीसीएन निर्माण के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ डी कुरिहारा; और हमारी पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ आर शिम। इस काम को जेएसपीएस काकेन्ही (अनुदान संख्या जेपी 20 एच 05 9 12, 20 एच 05778, 20 एच 0577 9) और एसएटीआरईपीएस कार्यक्रम (सं। जेएसटी और जेआईसीए के जेपीएमजेएसए 1706)।
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