Tomografia a emissione di positroni Imaging del traffico cellulare: un metodo di radiomarcatura cellulare

Summary

Qui viene presentato un protocollo per radiomarcare le cellule con un radioisotopo per tomografia a emissione di positroni (PET), 89 Zr (t_1/2 78,4 h), utilizzando un sintetizzatore radiomarcante pronto all’uso, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). La radiomarcatura delle cellule con [⁸⁹Zr]Zr-DBN consente il monitoraggio e l’imaging non invasivi delle cellule radiomarcate somministrate nell’organismo con PET fino a 7 giorni dopo la somministrazione.

Abstract

Le terapie con cellule T con cellule staminali e recettori chimerici dell’antigene (CAR) stanno emergendo come terapie promettenti per la rigenerazione degli organi e come immunoterapia per vari tipi di cancro. Nonostante siano stati compiuti progressi significativi in queste aree, c’è ancora molto da imparare per comprendere meglio la farmacocinetica e la farmacodinamica delle cellule terapeutiche somministrate nel sistema vivente. Per il monitoraggio non invasivo e in vivo delle cellule con tomografia a emissione di positroni (PET), è stato sviluppato un nuovo metodo di radiomarcatura cellulare mediato da [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina ([89 Zr]Zr-DBN) utilizzando ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). Il presente protocollo descrive un synthon radiomarcato [⁸⁹Zr]Zr-DBN-mediato, pronto all’uso, per la radiomarcatura diretta di una varietà di cellule, tra cui cellule staminali mesenchimali, cellule staminali cardiopoietiche guidate dal lignaggio, epatociti rigeneranti del fegato, globuli bianchi, cellule di melanoma e cellule dendritiche. La metodologia sviluppata consente l’imaging PET non invasivo del traffico cellulare fino a 7 giorni dopo la somministrazione senza influenzare la natura o la funzione delle cellule radiomarcate. Inoltre, questo protocollo descrive un metodo graduale per la radiosintesi di [89 Zr]Zr-DBN, la formulazione biocompatibile di [89 Zr]Zr-DBN, la preparazione delle cellule per la radiomarcatura e infine la radiomarcatura delle cellule con [⁸⁹Zr]Zr-DBN, compresi tutti i dettagli intricati necessari per il successo della radiomarcatura delle cellule.

Introduction

Le terapie a base di cellule T con cellule staminali e recettori chimerici dell’antigene (CAR) stanno guadagnando popolarità e sono in fase di studio attivo per il trattamento di varie malattie, come l’insufficienza miocardica^1,2, la degenerazione retinica 2, la degenerazione maculare 2, il diabete ², l’infarto del miocardio 3,4,5 e i tumori 6,7,8,9^.10. Tra i due approcci plausibili delle terapie con cellule staminali, le cellule staminali possono essere innestate direttamente sul sito della malattia per causare una risposta terapeutica o causare cambiamenti nel microambiente del sito della malattia senza aderire al sito della malattia per avviare una risposta terapeutica indiretta. Una risposta terapeutica indiretta potrebbe causare cambiamenti nel microambiente della sede della malattia rilasciando fattori che potrebbero riparare o trattare la malattia⁵. Questi approcci di terapie con cellule staminali potrebbero essere valutati mediante imaging non invasivo di cellule staminali radiomarcate. L’imaging non invasivo potrebbe correlare l’assorbimento delle cellule radiomarcate nel sito della malattia con una risposta terapeutica per decifrare la risposta terapeutica diretta rispetto a quella indiretta.

Inoltre, sono in fase di sviluppo terapie basate sulle cellule immunitarie per il trattamento di vari tumori utilizzando le cellule T CAR 6,7,8,9,10 e l’immunoterapia con cellule dendritiche ^11,12. Meccanicisticamente, nell’immunoterapia con cellule T CAR 6,7,8,9,10^, le cellule T sono ingegnerizzate per esprimere un epitopo che si lega a un antigene specifico sui tumori che deve essere trattato. Queste cellule CAR-T ingegnerizzate, al momento della somministrazione, si legano all’antigene specifico presente sulle cellule tumorali attraverso un’interazione epitopo-antigene. Dopo il legame, le cellule CAR-T legate subiscono l’attivazione e quindi proliferano e rilasciano citochine, che segnalano al sistema immunitario dell’ospite di attaccare il tumore che esprime l’antigene specifico. Al contrario, nel caso delle terapie con cellule dendritiche^11,12, le cellule dendritiche sono ingegnerizzate per presentare uno specifico antigene tumorale sulla loro superficie. Queste cellule dendritiche ingegnerizzate, quando somministrate, ospitano i linfonodi e si legano alle cellule T nei linfonodi. Le cellule T, legandosi agli antigeni tumorali specifici sulle cellule dendritiche somministrate, subiscono attivazione/proliferazione e avviano una risposta immunitaria dell’ospite contro il tumore che esprime quell’antigene specifico. Quindi, la valutazione del traffico di cellule CAR-T somministrate a un sito tumorale^9,10 e l’homing delle cellule dendritiche ai linfonodi^11,12 è possibile mediante imaging di cellule CAR-T radiomarcate e cellule dendritiche per determinare l’efficacia dell’immunoterapia. Inoltre, il traffico cellulare non invasivo può aiutare a comprendere meglio il potenziale terapeutico, chiarire la risposta terapeutica diretta rispetto a quella indiretta e prevedere e monitorare la risposta terapeutica delle terapie a base di cellule staminali e immunitarie.

Sono state esplorate diverse modalità di imaging per il traffico cellulare 3,4,9,10,12, tra cui l’imaging ottico^, la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT) e la tomografia a emissione di positroni (PET). Ognuna di queste tecniche ha i suoi vantaggi e svantaggi. Tra queste, la PET è la modalità più promettente grazie alla sua natura quantitativa e all’elevata sensibilità, che sono essenziali per la quantificazione affidabile delle cellule nel traffico cellulare^basato sull’imaging 3,4,9,10.

Il radioisotopo che emette positroni ⁸⁹Zr, con un’emivita di 78,4 ore, è adatto per la marcatura cellulare. Consente l’imaging PET del traffico cellulare per oltre 1 settimana ed è prontamente prodotto dai ciclotroni medici a bassa energia ampiamente disponibili 13,14,15,16,17. Inoltre, un chelante p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina (DFO-Bn-NCS) opportunamente funzionalizzato è disponibile in commercio per la sintesi di un synthon marcato con 89 Zr, pronto all’uso, marcante con cellule, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina, noto anche come [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Il principio della marcatura cellulare mediata da [89 Zr]Zr-DBN si basa su una reazione tra le ammine primarie delle proteine della membrana cellulare e la porzione isotiocianato (NCS) di [⁸⁹Zr]Zr-DBN per produrre un legame tiourea covalente stabile.

[⁸⁹Zr] L’etichettatura e l’imaging delle cellule basate su Zr-DBN sono state pubblicate per tracciare una varietà di cellule diverse, tra cui cellule staminali 18,23,25, cellule dendritiche¹⁸, cellule staminali cardiopoietiche¹⁹, cellule stromali deciduali 20, macrofagi derivati dal midollo osseo²⁰, cellule mononucleate del sangue periferico 20, cellule T Jurkat/CAR 21, epatociti ^22,24 e globuli bianchi ²⁵. Il seguente protocollo fornisce metodi passo-passo per la preparazione e la radiomarcatura delle cellule con [⁸⁹Zr]Zr-DBN e descrive le modifiche che possono essere richieste nel protocollo di radiomarcatura per un tipo di cellula specifico. Per maggiore chiarezza, il metodo di radiomarcatura delle cellule qui presentato è diviso in quattro sezioni. La prima sezione tratta della preparazione di [89 Zr]Zr-DBN mediante chelazione di ⁸⁹Zr con DFO-Bn-NCS. La seconda sezione descrive la preparazione di una formulazione biocompatibile di [⁸⁹Zr]Zr-DBN che può essere prontamente utilizzata per la radiomarcatura cellulare. La terza sezione riguarda le fasi necessarie per il precondizionamento delle cellule per la radiomarcatura. Il precondizionamento delle cellule comporta il lavaggio delle cellule con soluzione salina tamponata con fosfato privo di proteine (PBS) e soluzione salina bilanciata Hanks tamponata HEPES (H-HBSS) per rimuovere le proteine esterne, che potrebbero interferire o competere con la reazione di [⁸⁹Zr]Zr-DBN con ammine primarie presenti sulle proteine della superficie cellulare durante la radiomarcatura. La sezione finale fornisce le fasi coinvolte nell’effettiva radiomarcatura delle cellule e nell’analisi del controllo di qualità.

Protocol

Le cellule dendritiche e le cellule di melanoma sono state ottenute commercialmente18. Gli epatociti sono stati isolati dal fegato dei suini dopo epatectomia parziale laparoscopica22,24. Le cellule staminali sono state isolate da aspirati di midollo osseo18,19,26. Le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo sono state ottenute dal Laboratori…

Representative Results

I risultati rappresentativi presentati in questo manoscritto sono stati compilati dai precedenti studi di sintesi e radiomarcatura cellulare [89Zr]Zr-DBN 18,19,22,23,24,25. In breve, 89Zr può essere complessato con successo con DFO-Bn-NCS in ~30-60 minuti a 25-37 °C utilizzando 7,5-15 μg di DFO-Bn-NCS…

Discussion

Di seguito sono riportati i passaggi critici del protocollo che devono essere ottimizzati per un’efficace radiomarcatura cellulare. Nelle fasi 1.2 e 1.3 del protocollo, a seconda del volume di [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ o [⁸⁹Zr]ZrCl₄ impiegato, deve essere utilizzato un volume appropriato (microlitri) di base; La soluzione di 1,0 MK 2 CO 3 deve essere utilizzata per la neutralizzazione di [89 Zr]Zr(HPO 4)2 e la soluzione 1,0 M Na₂ CO_3</su…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG