Denne protokol beskriver den på hinanden følgende implantation af en osmotisk pumpe for at inducere abdominal aortaaneurisme ved angiotensin II-frigivelse i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulde mus og af en vaskulær adgangsport med et jugular venekateter til gentagen lægemiddelbehandling. Overvågning af aneurismeudvikling ved 3D-ultralyd udføres effektivt på trods af dorsale implantater.
Da der mangler farmaceutiske behandlingsmuligheder i den kliniske styring af abdominal aortaaneurisme (AAA), anvendes dyremodeller, især musemodeller, til at fremme forståelsen af sygdomspatogenesen og til at identificere potentielle terapeutiske mål. Test af nye lægemiddelkandidater for at blokere AAA-vækst i disse modeller kræver generelt gentagen lægemiddeladministration i løbet af eksperimentet. Her beskriver vi en kompileret protokol til AAA-induktion, indsættelse af et intravenøst kateter for at lette langvarig behandling og seriel AAA-overvågning ved 3D-ultralyd. Aneurismer induceres i apolipoprotein E (ApoE) mangelfulde mus ved angiotensin II frigivelse over 28 dage fra osmotiske mini-pumper implanteret subkutant i musens ryg. Derefter udføres den kirurgiske procedure for ekstern jugular venekateterisering for at muliggøre daglig intravenøs lægemiddelbehandling eller gentagen blodprøvetagning via en subkutan vaskulær adgangsknap. På trods af de to dorsale implantater lettes overvågningen af AAA-udvikling let ved sekventiel halvautomatisk 3D-ultralydsanalyse, som giver omfattende information om udvidelsen af aortadiameter og volumen og om aneurismemorfologi, som illustreret af eksperimentelle eksempler.
En abdominal aortaaneurisme (AAA) er en patologisk dilatation af et kar på grund af inflammatoriske og vævsdestruktive processer i aortavæggen, der i sidste ende kan føre til brud og patientdød. På trods af betydelige resultater inden for kirurgisk AAA-reparation mangler en konservativ lægemiddelbehandling for at blokere progressionen af aneurismeudvidelse og potentielt sænke risikoen for brud til dato. Dyremodeller er udviklet til at belyse udløsere og mediatorer af sygdommen og til at teste nye tilgange til terapi. Musemodeller af AAA anvendes bredt og dækker de forskellige observationer fra humant væv. På grund af deres patomekanistiske forskelle anvendes ofte mere end en model til at undersøge molekylers / vejes særlige funktion eller effektiviteten af potentielle terapeutiske lægemidler 1,2. Blandt de mest almindeligt anvendte modeller af AAA-induktion er angiotensin-II (Ang-II) administration i apolipoprotein E-mangelfuld (ApoE KO) mus3, som har mere kronisk-lignende patogenese sammenlignet med modeller, der er afhængige af aneurismedannelse fra en akut fornærmelse mod aortavæggen 4,5. Ang-II-modellen synes således særligt velegnet til overvågning af sygdomsprogression og har for nylig vist sig at ligne human AAS-sygdom meget med hensyn til metaboliske og inflammatoriske reaktioner6. Især indeholder Ang-II-modellen ikke kun AAA-udvikling, men også thoraxaneurismedannelse samt aortadissektion med intramural trombosedannelse.
Behandlinger, der sigter mod at målrette udviklingen af allerede etableret AAS snarere end at forhindre initiering af sygdommen, kan have højere translationel værdi, da patienter har en allerede eksisterende tilstand, der kræver behandling 7,8. For et sammenligneligt eksperimentelt design skal aortastørrelsen overvåges før og efter AAS-induktion for at definere en tærskel for sygdomsudvikling og potentielt stratificere mus i behandlingsgrupper.
Lægemiddeladministrationsmåden afhænger af optagelsen og stabiliteten af det pågældende stof. Intraperitoneale (i.p.) injektioner anvendes oftest på grund af deres lette anvendelse, ikke kræver bedøvelsesmiddel og manglen på injektionsvolumenbegrænsninger9. Farmakokinetik skal dog tages i betragtning ved valg af indgivelsesvej, da stoffer, der indgives i.p., primært absorberes gennem leverportalcirkulationen og kan gennemgå levermetabolisme, inden de når cirkulation, hvilket kan resultere i varierende plasmakoncentrationer afhængigt af den første passeffekt10. Intravenøs (i.v.) injektion giver den højeste biotilgængelighed af stoffer, og udfordringen med gentagen i.v.-adgang kan omgås ved brug af katetre og vaskulære adgangsporte til daglig administration 11,12,13. Med hensyn til AAS-indstillingen letter lægemiddeldistribution i omløb direkte eksponering for aneurisme ved definerede koncentrationer.
Her beskriver vi en arbejdsgang for inducering af AAA i Ang-II-musemodellen via subkutan implantation af en osmotisk pumpe, til daglig i.v. lægemiddelbehandling via en vaskulær adgangsport forbundet til et kateter indsat i den eksterne jugular vene samt til overvågning af aneurismestørrelse via 3D ultralyd14 på trods af tilstedeværelsen af to dorsale implantater.
Ang-II-modellen er en af de mest almindeligt anvendte musemodeller af AAA på grund af dens lave tekniske krav og særlige egenskaber, der ligner menneskelig sygdom 3,6. Operationstiden er ca. 10 minutter pr. Dyr, og den subkutane pumpeimplantation tolereres godt af musene, hvis den subkutane lomme er tilstrækkelig bred og placeret lavt på dyrets ryg væk fra snitstedet for ikke at forstyrre sårheling. Når huden er tæt omkring pumpen, kan der opstå vævsirritation, som kan forårsage betændelse og skorpedannelse og potentielt forstyrre pumpens frigivelsesmekanisme ved osmotisk tryk. Måling af mængden af Ang-II, der er tilbage i pumpen på tidspunktet for dyreofring, giver indsigt i, om Ang-II blev frigivet med succes i løbet af de 28 dage.
Ang-II-modellen er for nylig blevet foreslået at være velegnet til at studere aortaaneurisme og dissektionsprogression, da den udviser lighed med menneskelige træk ved begge6. Det er vigtigt, at test af lægemiddelkandidater til at blokere aortaudvidelse og påvirke ombygning ville matche den nuværende kliniske efterspørgsel. I vores eksperimentelle indstilling blev der defineret en cutoff for aneurismedannelse før behandlingsstart baseret på 125% volumenvækst på dag 8 i forhold til baseline, hvilket tegner sig for den naturlige variation i absolut aortastørrelse hos mus. Tærsklen og tidspunktet blev afledt af et indledende tidsforløb, der bekræftede ødelæggelse af aortavæggen i histologi (data ikke vist) og resulterede i 35% brud og 56% observerede AAA’er før kateterimplantation. Mens en minimumstærskel for etableret sygdom blev anvendt til undersøgelsesinklusion, blev det efterfølgende observeret, at et højt omfang af indledende aortaudvidelse også kan begrænse eksperimentel anvendelighed. Aneurismer, der hurtigt udviklede sig til >200% volumen på dag 8, voksede ikke yderligere ud over denne størrelse i 55% af tilfældene (figur 1D). Dette skal tages i betragtning under eksperimentelt design og beregning af prøvestørrelse, da det kan maskere en behandlings sande effekt. En anden facet af denne model er de hyppige aortabrud (thorax eller abdominal), der forekommer med hastigheder på 20% -40% og for det meste inden for de første 10 dage efter Ang-II pumpeimplantation 3,18,19. Ved at vælge starten af behandlingen til at være dag 9 blev der således opnået en høj grad af etablerede aneurismer, og jugular venekateteriseringen blev i det væsentlige udført på mus, der forventedes at overleve til slutningen af eksperimentet (kun 3/24 mus i vores historiske kontrolgruppe bristede efter dag 9), hvilket sparer tid, kræfter, og omkostninger.
Bortset fra aortabruddene, som udgør en alvorlig tilstand, blev den samtidige implantation af kateteret med vaskulær adgangsknap og den osmotiske pumpe tolereret godt af musene uden nogen bemærkelsesværdig effekt på mobilitet eller adfærd efter genopretning efter operationen. Den jugular venekateteriseringsprocedure bør tage ca. 30 minutter for uddannede forskere. Varigheden af eksponering for (isofluran) anæstesi bør holdes på et minimum, og dyrets vejrtrækningshastighed skal overvåges nøje for at forhindre vejrtrækningsdepression, hvilket kan føre til et dødeligt udfald, hvis det ikke løses20. Blodtab efter punktering af halsvenen til kateterindsættelse – hvilket fører til dyredød, hvis større – kan potentielt forekomme, når halsvenen ikke er korrekt ligeret kranialt, eller en sidegren, der føres ind i det isolerede område af karret, ikke er lukket. I så fald skal trykket med en vatpind påføres punkteringsstedet, indtil blodlækagen sænkes eller stopper, så kateterindsættelsen og ligeringen skal udføres så hurtigt som muligt; et lille stykke af kollagen sårforbinding kan midlertidigt anvendes til at hjælpe med hæmostase.
Kateterpatency er en af de vigtigste faktorer, da kateterafbrydelse fra venen eller adgangsknappen resulterer i forkert lægemiddelafgivelse, hvor lægemidlet lækker ind i det subkutane rum. Efter producentens anbefaling om mindst 3 mm overlapning mellem kateteret og metalforbindelsen blev der kun registreret et tilfælde af kateterafbrydelse på knapsiden (angivet ved den injicerede væske, der lækker fra snitstedet ved knappen) over 3 år i denne model (2020-2021, n = 73), som blev fastgjort ved at åbne såret og genoprette forbindelsen i kirurgi. Derudover blev der oplevet en kateterpatencysvigtrate på omkring 10% i vores historiske PBS-kontrolgruppe (2/21) på grund af enten kateterokklusion (hvilket gør det umuligt at injicere), kateterafbrydelse fra venen (indikeret ved tilsyneladende hævelse i nakken under injektion) eller sårhelingskomplikationer. Disse problemer kan være forbundet med selvpåførte skader, dvs. museridser eller bid. Især kan lægemiddelbehandlinger, der forstyrrer sårheling, øge fejlfrekvensen. Fejlfindingstrin til forbedring af patencyhastigheden omfatter forøgelse af længden af kateteret indsat i venen, sikring af, at ligaturer er tæt knyttet omkring kateteret og venen, og påføring af positivtryksteknikken efter producentens anbefaling, som beskrevet i trin 2.12.10., under injektion. Kateterpatency bør desuden verificeres på tidspunktet for dyreofring ved dissektion og visuel inspektion under mikroskopet. Bemærk, at den daglige mængde injiceret lægemiddelopløsning skal overvejes nøje. Da plasmavolumen regulerer blodtrykket, kan injektionsvolumenet påvirke AAA-ekspansion, og derfor skal kontroldyr modtage sham-proceduren med bærervolumen. Baseret på vores erfaring (og upublicerede observationer) synes en daglig mængde på op til 250 μL PBS at være veltolereret. Endelig kan der i lighed med pumpeimplantationen forekomme hudirritation omkring den implanterede vaskulære adgangsknap. Hvis der observeres betændelse ledsaget af devitaliseret eller nekrotisk væv, skal sårdebridering udføres ved at fjerne ikke-levedygtigt væv (nekrotisk væv vil ofte adskille sig naturligt fra såret), og huden skal sutureres om nødvendigt; hvis inflammation og nekrose er omfattende, skal dyrets velfærd og humane endepunkter overvejes i henhold til retningslinjerne.
Enkelt og dobbelt dorsal implantation af den osmotiske pumpe og / eller VAS forstyrrede ikke ultralydssignalet eller med at fastgøre musen i en passende position på ultralydsstadiet. Den automatiserede erhvervelse af 157 billeder over 12 mm for at gengive et 3D-billede af aorta til volumenmåling er en enkel og hurtig procedure14, som kun kræver, at aorta er fri for interferens over interesseområdet. En faldgrube i denne sammenhæng er at lægge for meget pres på transduceren, mens man forsøger at rydde billedet af interferens, hvilket kan afbryde den automatiserede måling, hvis vejrtrækningshastigheden påvirkes af kompressionen af ribbenene, når billeder af kranialenden af abdominal aorta registreres. Diameter måles traditionelt i billeder erhvervet ved hjælp af B-tilstand af operatøren manuelt at søge efter området med maksimal diameter, mens han udfører ultralydsanalysen. Et fremskridt på B-mode-billederne er EKV-billederne, som kan løse små aortabevægelser for at producere et højkvalitets, bremset billede af den pulserende aorta. Desuden kan den maksimale aortadiameter bestemmes ud fra de erhvervede 3D-rammer, hvor de 157 billeder giver et omfattende overblik over aorta taget ved systole (på grund af den indstillede EKG-udløser).
Afslutningsvis giver den præsenterede kompilerede protokol en pålidelig og reproducerbar arbejdsgang til i.v. lægemiddeladministration i en musemodel af Ang-II-induceret AAS og til overvågning af aortastørrelse ved 3D-ultralyd. Tidspunkterne for overvågning og drift kan tilpasses de specifikke behov, og halsvenekateteriseringen kan udføres separat for enhver eksperimentel opsætning, der kræver levering af specifikke stoffer via i.v. injektioner. VAS kan alternativt anvendes til gentagen blodprøvetagning, hvis der anvendes en kateterlåsopløsning for at forhindre koagulering. Den beskrevne 3D ultralydsprocedure kan tilpasses til at måle den infrarenale aorta, hvor aneurismer udvikler sig ved akut fornærmelse i elastase eller CaCl2-baserede musemodeller af AAA. Mens 3D-ultralydsopsamling har fordelen ved at give et overblik over den berørte aorta-region og aneurismemorfologi, er billedoptagelsen mere tidskrævende og kan derfor være mere omkostningskrævende. En anden begrænsning af protokollen, der bør anerkendes, er behovet for, at dyrene bedøves kortvarigt til intravenøse injektioner, mens intraperitoneal administration generelt udføres på bevidste mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke prof. Podessers og prof. Ellmeiers teams (afd. for biomedicinsk forskning og kernefacilitet for laboratoriedyravl og husdyrhold, Medical University of Vienna) for hjælp i dyreforsøgene. AAA trichrom farvning blev venligt udført af Monika Weiss og Prof. Peter Petzelbauer (Afd. for Dermatologi, Medical University of Vienna). Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabsfond [SFB-projekt F 5409-B21]. Marc Bailey er personligt støttet af British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
Hair removal cream | |||
Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
Small electric shaver | |||
Surigcal and microsurgical equipment | |||
Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |