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신경과학

뉴런 리소좀 상호작용과 근접 라벨링 단백질체학의 특성 분석

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

뉴런 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 동적 리소좀 미세 환경을 특성화하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 리소좀 막 단백질 및 리소좀과 (안정적으로 또는 일시적으로) 상호 작용하는 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 우수한 세포 내 공간 분해능으로이 방법으로 정확하게 정량화 할 수 있습니다.

Abstract

리소좀은 분해 및 기타 다양한 세포 기능을 달성하기 위해 다양한 생체 분자와 자주 통신합니다. 리소좀은 인간의 뇌 기능에 매우 중요한데, 뉴런은 유사분열 후 세포성이고 세포 항상성을 유지하기 위해 자가포식-리소좀 경로에 크게 의존하기 때문입니다. 다양한 리소좀 기능에 대한 이해의 발전에도 불구하고 리소좀과 다른 세포 구성 요소 간의 매우 역동적인 통신을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 여기서, 최근 발표된 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 뉴런에서의 내인(knock-in) 리소좀 근접표지 단백질체에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다.

리소좀 막 단백질과 반경 10-20nm 이내의 리소좀을 둘러싼 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 확실하게 식별하고 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 프로토콜의 각 단계, 즉 hiPSC-뉴런 배양, 근접 라벨링, 뉴런 수확, 형광 현미경, 비오틴화 단백질 농축, 단백질 분해, LC-MS 분석 및 데이터 분석에 대해 자세히 설명합니다. 요약하면, 이 독특한 내인성 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 방법은 살아있는 인간 뉴런에서 매우 역동적인 리소좀 활성을 연구하기 위한 고처리량의 강력한 분석 도구를 제공합니다.

Introduction

리소좀은 리소좀-자가포식 경로1을 통해 거대분자를 분해하는 이화작용 소기관입니다. 분해 외에도 리소좀은 신호 전달, 영양소 감지 및 분비 2,3,4와 같은 다양한 세포 기능에 관여합니다. 리소좀 기능의 섭동은 리소좀 저장 장애, 암, 노화 및 신경 퇴행과 관련이 있습니다 3,5,6,7. 유사분열 후 및 고도로 편광된 뉴런의 경우, 리소좀은 뉴런 세포 항상성, 신경 전달 물질 방출 및 축삭 8,9,10,11을 따른 장거리 수송에 중요한 역할을 합니다. 그러나 인간 뉴런에서 리소좀을 조사하는 것은 어려운 작업이었습니다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 유래 뉴런 기술의 최근 발전으로 이전에는 접근 할 수 없었던 살아있는 인간 뉴런의 배양이 가능해져 동물 모델과 인간 환자 간의 격차를 해소하여 인간의 뇌를 연구합니다12,13. 특히, 진보 된 i3뉴런 기술은 독시사이클린 유도 성 프로모터 하에서 뉴로 게닌 -2 전사 인자를 iPSC 게놈에 안정적으로 통합하여 iPSC가 2 주 만에 순수한 피질 뉴런으로 분화하도록 유도합니다14,15.

매우 역동적인 리소좀 활성으로 인해 다른 세포 구성 요소와의 리소좀 상호 작용을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 근접 라벨링 기술은 탁월한 공간 특이성으로 안정 및 일시적 / 약한 단백질 상호 작용을 모두 캡처 할 수 있기 때문에 이러한 동적 상호 작용을 연구하는 데 적합합니다16,17. 조작된 퍼옥시다아제 또는 비오틴 리가아제는 미끼 단백질에 유전적으로 융합될 수 있습니다. 활성화 시, 반응성이 높은 비오틴 라디칼이 생성되어 이웃 단백질을 공유 표지하고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 플랫폼 17,18,19,20,21을 통해 다운스트림 상향식 단백질체학을 위한 스트렙타비딘 코팅 비드에 의해 농축될 수 있습니다.

내인성 리소좀 근접 표지 단백질체학 방법이i3뉴런22에서 동적 리소좀 미세환경을 포착하기 위해 최근에 개발되었다. 조작된 아스코르브산 과산화효소(APEX2)는 iPSC의 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)의 C-말단에 녹인되었으며, 이는 피질 뉴런으로 분화될 수 있습니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이며 고전적인 리소좀 마커23입니다. LAMP1은 또한 리소좀으로 성숙하는 후기 엔도좀에서 발현됩니다. 이러한 후기 엔도솜-리소좀과 비분해성 리소좀은 모두 이 프로토콜에서 리소좀이라고 합니다. 생리학적 수준에서 발현되는 이 내인성 LAMP1-APEX 프로브는 LAMP1 오국소화 및 과발현 인공물을 줄일 수 있습니다. 수백 개의 리소좀 막 단백질과 리소좀 인터랙터는 살아있는 인간 뉴런에서 뛰어난 공간 분해능으로 식별하고 정량화할 수 있습니다.

여기서, 인간 iPSC 유래 뉴런에서 리소좀 근접 표지 단백질체학에 대한 상세한 프로토콜이 최근에 공개된 방법(22)으로부터의 추가적인 개선과 함께 기술된다. 전체 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에는 hiPSC 유래 뉴런 배양, 뉴런의 근접 라벨링 활성화, 형광 현미경을 통한 APEX 활성 검증, 최적의 스트렙타비딘 비드 대 입력 단백질 비율 결정, 비오틴화 단백질 농축, 온비드 단백질 분해, 펩타이드 탈염 및 정량화, LC-MS 분석 및 단백질체학 데이터 분석이 포함됩니다. 문제 해결 지침 및 실험 최적화도 근접 라벨링 품질 관리 및 성능을 개선하기 위해 논의됩니다.

Protocol

모든 절차는 조지 워싱턴 대학교 생물 안전 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 배지 및 완충액의 조성은 표 1에 제공된다. 여기에 사용된 상업용 제품 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 1. 인간 iPSC 유래 뉴런 배양 인간 iPSC 배양 및 LAMP1-APEX 프로브 통합(7일)Matrigel 원액을 4°C의 얼음 양동이에 밤새 해동…

Representative Results

이 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 연구는 살아있는 뉴 런에서 동적 리소좀 미세 환경을 포착하기 위해 인간 iPSC 유래 뉴런에서 수행되었습니다. 상이한 시점에서의 hiPSC 및 hiPSC-유래 뉴런의 세포 형태가 도 2A에 예시되어 있다. 인간 iPSC는 E8 배지의 콜로니에서 자랍니다. 분화는 iPSC를 독시사이클린 함유 뉴런 유도 배지로 도금함으로써 시작됩니다. 신경 돌기 확장은 3…

Discussion

이 LAMP1-APEX 프로브를 사용하여 리소좀 막 위와 근처의 단백질이 비오틴화되고 농축됩니다. 100-1,200 nm의 일반적인 리소좀 직경을 감안할 때,이 방법은 10-20 nm 표지 반경으로 우수한 세포 내 분해능을 제공합니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이자 리소좀의 고전적인 마커로, 내인성 발현 수준에서 리소좀 APEX 라벨링을 위한 우수한 미끼 단백질 역할을 합니다. 그러나, LAMP1이 후기 엔도솜 및 비분?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH 보조금(R01NS121608)의 지원을 받습니다. AMF는 ARCS-Metro Washington Chapter 장학금과 Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship을 인정합니다. 우리는 분자 생물학 지원과 i3뉴런 기술 개발에 대해 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)의 마이클 워드 연구소에 감사드립니다.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
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References

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Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
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