يصف هذا البروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية (exosomes و microvesicles) من MSCs البشرية المستزرعة. يتم شرح المزيد من التطبيقات لهذه المركبات الكهربائية أيضا في هذه المقالة.
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية غشائية غير متجانسة تطلقها معظم أنواع الخلايا ، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد كمنظمات فسيولوجية للتوازن العضوي ومؤشرات مهمة للأمراض. وفي غضون ذلك، بدأت تظهر إمكاناتها الهائلة لإنشاء علاجات للأمراض يمكن السيطرة عليها ويمكن السيطرة عليها. يمكن للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إطلاق كميات كبيرة من EVs في الثقافة ، والتي أظهرت وعدا ببدء تجديد الأنسجة بشكل فعال وتسهيل التطبيقات العلاجية واسعة النطاق مع قابلية جيدة للتوسع والتكاثر. هناك طلب متزايد على بروتوكولات بسيطة وفعالة لجمع وتطبيق MSC-EVs. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية التمثيلية من MSCs البشرية المستزرعة ، والإكسوسومات ، والحويصلات الدقيقة لمزيد من التطبيقات. تظهر قابلية التكيف لهذه الطريقة لسلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع MSC-EVs وتطبيقها بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.
الخلايا الجذعية هي خلايا متعددة القدرات غير متمايزة ذات قدرة على التجديد الذاتي وإمكانات متعدية1. يتم عزل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بسهولة وزراعتها وتوسيعها وتنقيتها في المختبر ، والتي تظل مميزة للخلايا الجذعية بعد ممرات متعددة. في السنوات الأخيرة ، دعمت الأدلة المتزايدة الرأي القائل بأن MSCs تعمل في وضع paracrine في الاستخدام العلاجي 2,3. يلعب إفراز الحويصلات خارج الخلية (EVs) بشكل خاص دورا حاسما في التوسط في الوظائف البيولوجية ل MSCs. كجسيمات نانوية غشائية غير متجانسة يتم إطلاقها من معظم أنواع الخلايا ، تتكون EVs من فئات فرعية تسمى exosomes (Exos) ، والحويصلات الدقيقة (MVs) ، وحتى الأجسام المبرمج الأكبر 4,5. من بينها ، Exos هو EV الأكثر دراسة على نطاق واسع بحجم 40-150 نانومتر ، وهو من أصل endosomal ويفرز بنشاط في الظروف الفسيولوجية. تتشكل MVs عن طريق سفك مباشرة من سطح غشاء بلازما الخلية بقطر 100-1000 نانومتر ، والتي تتميز بالتعبير العالي عن الفوسفاتيديل سيرين والتعبير عن العلامات السطحية للخلايا المانحة6. تحتوي EVs على الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات النشطة بيولوجيا الأخرى ، والتي لها وظائف مماثلة للخلايا الأم وتلعب دورا مهما في اتصال الخلايا والاستجابة المناعية وإصلاح تلف الأنسجة7. تم التحقيق على نطاق واسع في MSC-EVs كأداة علاجية قوية خالية من الخلايا في الطب التجديدي8.
يعد عزل وتنقية المركبات الكهربائية المشتقة من MSC مشكلة شائعة في مجال البحث والتطبيق. في الوقت الحاضر ، الطرد المركزي التفاضلي والكثافة9 ، عملية الترشيح الفائق 10 ، الفصل المغناطيسي المناعي 11 ، كروماتوجراف الاستبعاد الجزيئي12 ، ورقاقة الموائع الدقيقة13 هي طرق مستخدمة على نطاق واسع في عزل وتنقية المركبات الكهربائية. مع مزايا وعيوب كل نهج ، لا يمكن تلبية كمية ونقاء ونشاط المركبات الكهربائية المجمعة في نفس الوقت14,15. في هذه الدراسة ، يتم عرض بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من MSCs المستزرعة بالتفصيل ، مما دعم الاستخدام العلاجي الفعال16،17،18،19،20. كما تم تقديم مثال على قابلية هذه الطريقة للتكيف مع سلسلة من الأساليب النهائية ، مثل وضع العلامات الفلورية ، والزرع المحلي ، والحقن الجهازي. سيعالج تنفيذ هذا الإجراء الحاجة إلى جمع وتطبيق MSC-EVs بشكل بسيط وموثوق في الأبحاث الانتقالية.
تظهر المركبات الكهربائية لتلعب دورا مهما في الأنشطة البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك عرض المستضد ، ونقل المواد الوراثية ، وتعديل البيئة الدقيقة للخلايا ، وغيرها. علاوة على ذلك ، فإن تطبيقها على نطاق واسع يجلب مناهج وفرصا جديدة لتشخيص الأمراض وعلاجها21. يعتمد تنفيذ التطبيقات ا…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81930025 و 82170988) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة المقدمة من المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU) والمختبر المركزي التحليلي والاختبار لمركز الابتكار الطبي العسكري التابع لجامعة الطب للقوات الجوية.
10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |