Isolering, karakterisering og terapeutisk anvendelse af ekstracellulære vesikler fra dyrkede humane mesenkymale stamceller

Summary

Denne protokol beskriver differentiel centrifugering til isolering og karakterisering af repræsentative EV’er (exosomer og mikrovesikler) fra dyrkede humane MSC’er. Yderligere anvendelser af disse elbiler forklares også i denne artikel.

Abstract

Ekstracellulære vesikler (EV’er) er heterogene membrannanopartikler frigivet af de fleste celletyper, og de anerkendes i stigende grad som fysiologiske regulatorer af organismehomeostase og vigtige indikatorer for patologier; I mellemtiden er deres enorme potentiale for at etablere tilgængelige og kontrollerbare sygdomsbehandlinger ved at dukke op. Mesenkymale stamceller (MSC’er) kan frigive store mængder EV’er i kultur, hvilket har vist løfte om at kickstarte effektiv vævsregenerering og lette omfattende terapeutiske anvendelser med god skalerbarhed og reproducerbarhed. Der er en stigende efterspørgsel efter enkle og effektive protokoller til indsamling og anvendelse af MSC-EV’er. Her leveres en detaljeret protokol baseret på differentiel centrifugering for at isolere og karakterisere repræsentative elbiler fra dyrkede humane MSC’er, exosomer og mikrovesikler til yderligere applikationer. Tilpasningsevnen af denne metode er vist for en række downstream-tilgange, såsom mærkning, lokal transplantation og systemisk injektion. Gennemførelsen af denne procedure vil imødekomme behovet for enkel og pålidelig indsamling og anvendelse af MSC-EV’er i translationel forskning.

Introduction

Stamceller er udifferentierede pluripotente celler med evne til selvfornyelse og translationelt potentiale¹. Mesenkymale stamceller (MSC’er) isoleres, dyrkes, udvides og renses let i laboratoriet, hvilket stadig er karakteristisk for stamceller efter flere passager. I de senere år har stigende dokumentation støttet det synspunkt, at MSC’er virker i en parakrin tilstand i terapeutisk brug ^2,3. Især udskillelsen af ekstracellulære vesikler (EV’er) spiller en afgørende rolle i formidlingen af MSC’ernes biologiske funktioner. Som heterogene membranøse nanopartikler frigivet fra de fleste celletyper består EV’er af underkategorier kaldet exosomer (Exos), mikrovesikler (MV’er) og endnu større apoptotiske legemer ^4,5. Blandt dem er Exos den mest undersøgte EV med en størrelse på 40-150 nm, som er af endosomal oprindelse og aktivt udskilles under fysiologiske forhold. MV’er dannes ved afgivelse direkte fra overfladen af celleplasmamembranen med en diameter på 100-1.000 nm, som er kendetegnet ved høj ekspression af phosphatidylserin og ekspression af overflademarkører af donorceller⁶. EV’er indeholder RNA, proteiner og andre bioaktive molekyler, som har lignende funktioner som modercellerne og spiller en væsentlig rolle i cellekommunikation, immunrespons og reparation af vævsskader⁷. MSC-EV’er er blevet bredt undersøgt som et kraftfuldt cellefrit terapeutisk værktøj i regenerativ medicin⁸.

Isolering og rensning af MSC-afledte elbiler er et almindeligt problem inden for forskning og anvendelse. På nuværende tidspunkt er differentiel og densitetsgradient ultracentrifugering⁹, ultrafiltreringsproces 10, immunomagnetisk separation¹¹, molekylær eksklusionskromatograf 12 og mikrofluidisk chip¹³ almindeligt anvendte metoder til isolering og oprensning af elbiler. Med fordele og ulemper ved hver tilgang kan mængden, renheden og aktiviteten af indsamlede elbiler ikke opfyldes på samme tid^14,15. I denne undersøgelse vises differentialcentrifugeringsprotokollen for isolering og karakterisering af EV’er fra dyrkede MSC’er i detaljer, hvilket har understøttet effektiv terapeutisk anvendelse 16,17,18,19,20. Tilpasningsevnen af denne metode til en række downstream-tilgange, såsom fluorescerende mærkning, lokal transplantation og systemisk injektion, er yderligere blevet eksemplet. Gennemførelsen af denne procedure vil imødekomme behovet for enkel og pålidelig indsamling og anvendelse af MSC-EV’er i translationel forskning.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care and Use Committee of the Fourth Military Medical University og udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Otte uger gamle C57Bl/6 mus (ingen præference for hverken hunner eller hanner) blev brugt. Kryopræserverede MSC’er afledt af human navlestreng (UCMSC’er), der blev anvendt til denne undersøgelse, blev indhentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel). Anvendelsen af humane celler blev …

Representative Results

MV’er og Exos fra dyrkede humane UCMSC’er isoleres efter den eksperimentelle arbejdsgang (figur 1). NTA-resultaterne viser, at størrelsen af Exos fra humane MSC’er varierer fra 40 nm til 335 nm med en topstørrelse på ca. 100 nm, og størrelsen af MV’er varierer fra 50 nm til 445 nm med en topstørrelse på 150 nm (figur 2). Morfologisk karakterisering af MSC-afledte Exos udviser en typisk kopform (figur 3). Elbiler mærkes effekt…

Discussion

EV’er dukker op til at spille en vigtig rolle i forskellige biologiske aktiviteter, herunder antigenpræsentation, transport af genetisk materiale, cellemikromiljømodifikation og andre. Desuden medfører deres brede anvendelse nye tilgange og muligheder for diagnosticering og behandling af sygdomme²¹. Implementering af terapeutiske anvendelser af EV’er er baseret på vellykket isolering og karakterisering. På grund af manglen på standardiserede isolerings- og rensningsmetoder og den lave ekstra…

Materials

10% povidone-iodine (Betadine)	Weizhenyuan	10053956954292	Wound disinfection
Calibration solution	Particle Metrix	110-0020	Calibrate the NTA instrument
Carprofen	Sigma	53716-49-7	Analgesic medicine
Caudal vein imager	KEW Life Science	KW-XXY	Caudal vein imager
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Fatal bovine serum	Corning	35-081-CV	Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh	PBL Assay Science	24916-25	Transmission electron microscope
Heating pad	Zhongke Life Science	Z8G5JBMz	Post-treatment care of animals
Heparin Solution	StemCell	7980	Systemic injection
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22	Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer	Particle Metrix	ZetaView PMX120	Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid	Solarbio	12501-23-4	Transmission electron microscope
Pipette	Eppendorf	3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma-Aldrich	MINI26	Labeling EVs
Skin biopsy punch	Acuderm	69038-10-50	Skin defects
Software ZetaView	Particle Metrix	Version 8.05.14 SP7
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Transmission electron microscope
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge	Beckman	XPN-100	Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system	Milli-Q	IQ 7000	Preparation of ultrapure water