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Biochemistry

レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64136
, , , ,
1Laboratory of Genetics,The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics,The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry,University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology,University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology,The Scripps Research Institute

Summary

本プロトコルは、クライオEM実験における傾斜した単一粒子データ収集のための一般化された実装が容易なスキームを記述している。このような手順は、空気-水界面への付着による優先配向バイアスに苦しんでいるサンプルの高品質のEMマップを取得するのに特に役立ちます。

Abstract

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)による単粒子分析(SPA)は、現在、高分解能構造生物学の主流技術です。SPAによる構造決定は、氷の薄い層内でガラス化された高分子オブジェクトの複数の異なるビューを取得することに依存しています。理想的には、均一に分布したランダムな投影方向の集まりは、オブジェクトのすべての可能なビューになり、等方性の方向分解能を特徴とする再構成を引き起こします。しかし、実際には、多くのサンプルは、空気と水の界面に付着する優先配向粒子に苦しんでいます。これにより、データセット内の不均一な角度方位分布と再構成における不均一なフーリエ空間サンプリングが発生し、異方性分解能を特徴とするマップに変換されます。試料ステージを傾けると、方位分布の均一性、ひいてはフーリエ空間サンプリングの等方性が改善されるため、分解能異方性を克服するための一般化可能な解決策が提供されます。本プロトコルは、自動画像取得のためのソフトウェアであるLeginonを用いた傾斜ステージ自動データ収集戦略を記述する。この手順は実装が簡単で、追加の機器やソフトウェアを必要とせず、生体高分子のイメージングに使用されるほとんどの標準的な透過型電子顕微鏡(TEM)と互換性があります。

Introduction

過去10年間の直接電子検出器の出現1,2,3は、単一粒子クライオEM4,5,6を使用して解決された高分子および高分子集合体の高分解能構造の数が指数関数的に増加しました。ほとんどすべての精製高分子種は、サイズが~10 kDa以下の最小のタンパク質を除いて、クライオEMを使用した構造決定に適していると予想されます。グリッド調製および構造決定に必要な出発物質の量は、核磁気共鳴分光法およびX線結晶構造解析などの他の構造決定技術よりも少なくとも桁違いに少ない4,5,6。

しかし、クライオEMによる構造決定の主な課題は、イメージングに適したグリッド調製です。さまざまなガラス化戦略とグリッドを使用して多様なサンプルを評価する広範な研究では、クライオEMグリッド上のサンプルをガラス化するためのほとんどのアプローチが、空気-水界面への高分子の優先接着につながることが示唆されました8。このような遵守は、潜在的に4つの最適ではない結果を引き起こす可能性があります:(1)高分子サンプルは完全に変性し、その場合、データ収集と処理を成功させることはできません。(2)サンプルが部分的に変性し、その場合、損傷を受けていない高分子の領域から構造的洞察を得ることができる可能性があります。(3)サンプルはネイティブ構造を保持していますが、電子ビームの方向に対する粒子の向きは1セットのみで画像に表されています。(4)サンプルはネイティブ構造を保持しており、電子ビームの方向に対する可能な粒子の向きがすべてではないが一部が画像に表されています。ケース(3)および(4)の場合、傾斜データ収集は、再構築されたクライオEMマップに影響を与える方向分解能異方性を最小限に抑えるのに役立ち、さまざまなサンプルに対して一般化可能なソリューションを提供します9。技術的には、変性はおそらく空気と水の界面で発生し、同様にデータ内で表される異なる方向の数を制限するため、傾斜はケース(2)にも利益をもたらす可能性があります。データセットの配向バイアスの程度は、溶液添加剤を試すことで変更できる可能性がありますが、幅広い適用性の欠如は、これらの試行錯誤のアプローチを妨げます。単一の最適化された傾斜角度で試料ステージを傾けることは、イメージング実験9 の形状を変更することにより、向きの分布を改善するのに十分である(図1)。電子線に対する優先配向試料の幾何学的構成に起因して、優先配向の各クラスターについて、グリッドを傾けると、クラスター重心に対する照明角度の円錐を生成する。したがって、これによりビューが広がり、その結果、フーリエ空間サンプリングと方向分解能の等方性が向上します。

実際には、ステージを傾けることにはいくつかの欠点があります。試料ステージを傾けると、視野全体に焦点勾配が導入され、コントラスト伝達関数(CTF)推定の精度に影響を与える可能性があります。傾斜したデータ収集は、傾斜した試料をイメージングする際の帯電効果の増加によって引き起こされるビーム誘起粒子の動きの増加にもつながる可能性があります。グリッドの傾きはまた、見かけの氷の厚さの増加につながり、それが今度はよりノイズの多い顕微鏡写真につながり、最終的には再構成の解像度に影響を与える可能性があります5、9、10。プロトコルとディスカッションのセクションで簡単に説明されている高度な計算データ処理スキームを適用することで、これらの問題を克服できる場合があります。最後に、傾けると粒子のオーバーラップが増加し、その後の画像処理パイプラインが妨げられる可能性があります。これは、グリッド上の粒子濃度を最適化することである程度軽減できますが、それでも重要な考慮事項です。ここでは、Leginonソフトウェアスイート(自動画像取得ソフトウェア)を使用した傾斜データ収集のための実装が簡単なプロトコルが説明され、オープンアクセスが利用可能で、広範囲の顕微鏡と互換性がある11、12、13、14。この方法には少なくともバージョン3.0以降が必要であり、バージョン3.3以降には、傾斜したデータ収集を可能にするための専用の改善が含まれています。このプロトコルには、追加のソフトウェアや機器は必要ありません。計算インフラストラクチャとインストールガイドに関する広範な手順は、他の場所で提供されています15。

Protocol

1. サンプル調製 金箔と金グリッドサポート16 ( 材料表を参照)を含むグリッドを使用すると、傾斜したデータ収集がビーム誘起運動を強調する可能性があるため17。注:本研究では、グリッド上のサンプルを、加湿された(80%を超える)冷蔵室(~4°C)で手動プランジおよびブロッティング技術18 を使用してガラ…

Representative Results

0.3 mg/mLのDPSを使用して、0°、30°、および60°の傾斜でのイメージングを実証しました。異なる傾斜角度からのデータは、異なるグリッド領域の同じグリッド上で収集された。この研究の3つのデータセットを比較する場合と同様に、より高い角度の傾きに対するCTF解像度の適合度は低くなる傾向があります。 図4 は、比較代表画像と2D分類平均を示しています。タンパク?…

Discussion

空気-水界面への試料の付着によって引き起こされる好ましい粒子配向は、クライオEM SPA 4,5,6を使用した日常的な高分解能構造決定の最後の主要なボトルネックの1つです。ここで紹介するデータ収集スキームは、データセット内の粒子の配向分布を改善するための実装が容易な戦略を提供します。このプロトコルは追加の?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ビル・アンダーソン、チャールズ・ボウマン、ジャン・クリストフ・デュコム(TSRI)の顕微鏡、レギノンの設置、データ転送インフラストラクチャの支援に感謝します。また、ゴードン・ルイ(ソーク研究所)とヨン・ジ・タン(シンガポール国立大学)にも、原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。DPS発現用のプラスミドを提供してくださったChris Russo(ケンブリッジMRC分子生物学研究所)に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(U54AI150472、U54 AI170855、およびR01AI136680からDL)、国立科学財団(NSF MCB-2048095からDL)、ハースト財団(DL)、およびアーサーとジュリーウッドロウチェア(JPNへ)からの助成金によってサポートされました。

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01
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References

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Cryo-EMSingle-particle AnalysisStage TiltParticle OrientationData CollectionEucentric HeightImage ShiftFocusHole FindingAutomated Targeting
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Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).
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