Collecte de données cryo-EM à particule unique avec inclinaison de scène à l’aide de Leginon

Summary

Le présent protocole décrit un schéma généralisé et facile à mettre en œuvre pour la collecte de données à une seule particule inclinée dans les expériences cryo-EM. Une telle procédure est particulièrement utile pour obtenir une carte EM de haute qualité pour les échantillons souffrant d’un biais d’orientation préférentielle dû au respect de l’interface air-eau.

Abstract

L’analyse monoparticulaire (SPA) par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) est maintenant une technique courante pour la biologie structurale à haute résolution. La détermination de la structure par SPA repose sur l’obtention de plusieurs vues distinctes d’un objet macromoléculaire vitrifié dans une fine couche de glace. Idéalement, une collection d’orientations de projection aléatoires uniformément réparties équivaudrait à toutes les vues possibles de l’objet, donnant lieu à des reconstructions caractérisées par une résolution directionnelle isotrope. Cependant, en réalité, de nombreux échantillons souffrent de particules orientées préférentiellement adhérant à l’interface air-eau. Cela conduit à des distributions d’orientation angulaire non uniformes dans l’ensemble de données et à un échantillonnage inhomogène de l’espace de Fourier dans la reconstruction, se traduisant par des cartes caractérisées par une résolution anisotrope. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon fournit une solution généralisable pour surmonter l’anisotropie de résolution en améliorant l’uniformité des distributions d’orientation, et donc l’isotropie de l’échantillonnage de l’espace de Fourier. Le présent protocole décrit une stratégie de collecte automatisée de données à étapes inclinées à l’aide de Leginon, un logiciel d’acquisition automatisée d’images. La procédure est simple à mettre en œuvre, ne nécessite aucun équipement ou logiciel supplémentaire et est compatible avec la plupart des microscopes électroniques à transmission (MET) standard utilisés pour l’imagerie des macromolécules biologiques.

Introduction

L’avènement des détecteurs d’électrons directs au cours de la dernière décennie ^1,2,3 a entraîné une augmentation exponentielle du nombre de structures à haute résolution de macromolécules et d’assemblages macromoléculaires résolus à l’aide de cryo-EM 4,5,6 à particule unique. Presque toutes les espèces macromoléculaires purifiées devraient pouvoir être déterminées par cryo-EM, à l’exception des plus petites protéines ~10 kDa de taille ou inférieure à⁷. La quantité de matière de départ nécessaire pour la préparation de la grille et la détermination de la structure est inférieure d’au moins un ordre de grandeur à celle d’autres techniques de détermination de structure, telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et la cristallographie aux rayons X ^4,5,6.

Cependant, l’un des principaux défis pour la détermination de la structure par cryo-EM implique une préparation de grille appropriée pour l’imagerie. Une étude approfondie évaluant divers échantillons à l’aide de différentes stratégies et grilles de vitrification a suggéré que la plupart des approches de vitrification d’échantillons sur des grilles cryo-EM conduisent à une adhésion préférentielle des macromolécules à l’interface air-eau⁸. Une telle observance peut potentiellement entraîner quatre résultats sous-optimaux : (1) l’échantillon macromoléculaire se dénature complètement, auquel cas aucune collecte et traitement de données réussis n’est possible ; (2) l’échantillon se dénature partiellement, auquel cas il peut être possible d’obtenir des informations structurelles à partir de régions de la macromolécule qui ne sont pas endommagées; (3) l’échantillon conserve sa structure native, mais un seul ensemble d’orientations de particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons est représenté dans les images; (4) L’échantillon conserve sa structure native, et certaines orientations possibles des particules par rapport à la direction du faisceau d’électrons sont représentées dans les images. Pour les cas (3) et (4), la collecte de données inclinée aidera à minimiser l’anisotropie de résolution directionnelle affectant la carte cryo-EM reconstruite et fournira une solution généralisable pour une grande variété d’échantillons⁹. Techniquement, l’inclinaison peut également bénéficier au cas (2), puisque la dénaturation se produit vraisemblablement à l’interface air-eau et limite de la même manière le nombre d’orientations distinctes représentées dans les données. L’étendue du biais d’orientation dans l’ensemble de données peut potentiellement être modifiée en expérimentant avec des additifs de solution, mais un manque d’applicabilité générale entrave ces approches par essais et erreurs. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon à un seul angle d’inclinaison optimisé est suffisant pour améliorer la distribution des orientations en modifiant la géométrie de l’expérience d’imagerie⁹ (Figure 1). En raison de la configuration géométrique de l’échantillon préférentiellement orienté par rapport au faisceau d’électrons, pour chaque groupe d’orientations préférentielles, l’inclinaison de la grille génère un cône d’angles d’éclairage par rapport au centroïde de l’amas. Par conséquent, cela répartit les vues et améliore par conséquent l’échantillonnage de l’espace de Fourier et l’isotropie de la résolution directionnelle.

Il y a, dans la pratique, certains inconvénients à incliner la scène. L’inclinaison de l’étage de l’échantillon introduit un dégradé de mise au point dans le champ de vision, ce qui peut affecter la précision des estimations de la fonction de transfert de contraste (CTF). La collecte de données inclinée peut également entraîner une augmentation du mouvement des particules induit par le faisceau causée par des effets de charge accrus lors de l’imagerie d’échantillons inclinés. L’inclinaison de la grille entraîne également une augmentation de l’épaisseur apparente de la glace, ce qui entraîne des micrographies plus bruyantes et peut finalement avoir un impact sur la résolution des reconstructions 5,9,10. Il peut être possible de surmonter ces problèmes en appliquant des schémas de traitement informatique avancés qui sont brièvement décrits dans les sections protocole et discussion. Enfin, l’inclinaison peut entraîner une augmentation du chevauchement des particules, ce qui entrave le pipeline de traitement d’image ultérieur. Bien que cela puisse être atténué dans une certaine mesure en optimisant la concentration de particules sur le réseau, il s’agit néanmoins d’une considération importante. Ici, un protocole simple à mettre en œuvre est décrit pour la collecte de données inclinées à l’aide de la suite logicielle Leginon (un logiciel d’acquisition d’images automatisé), disponible en libre accès et compatible avec une large gamme de microscopes^11,12,13,14. La méthode nécessite au moins la version 3.0 ou supérieure, avec les versions 3.3 et ultérieures contenant des améliorations dédiées pour permettre la collecte de données inclinée. Aucun logiciel ou équipement supplémentaire n’est nécessaire pour ce protocole. Des instructions détaillées sur l’infrastructure informatique et des guides d’installation sont fournis ailleurs¹⁵.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon Utilisez des grilles contenant une feuille d’or et un support de grille d’or16 (voir le tableau des matériaux), car la collecte de données inclinée peut accentuer le mouvement induit par le faisceau17.NOTE: Pour la présente étude, des échantillons sur grilles ont été vitrifiés à l’aide de la technique manuelle de plongeon et de buvardage18 dans une cha…

Representative Results

Le DPS à 0,3 mg/mL a été utilisé pour démontrer l’imagerie à des inclinaisons de 0°, 30° et 60°. Des données provenant de différents angles d’inclinaison ont été recueillies sur la même grille dans différentes régions du réseau. La résolution CTF adaptée aux inclinaisons d’angle plus élevées a tendance à être plus faible, comme ce fut le cas lors de la comparaison des trois ensembles de données de cette étude. La figure 4 montre des images représentatives comp…

Discussion

L’orientation préférée des particules causée par l’adhérence de l’échantillon à l’interface air-eau est l’un des derniers goulots d’étranglement majeurs à la détermination de routine de la structure à haute résolution à l’aide de cryo-EM SPA ^4,5,6. Le schéma de collecte de données présenté ici fournit une stratégie facile à mettre en œuvre pour améliorer la distribution d’orientation des part…

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01