Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Summary

В настоящем протоколе описана обобщенная и простая в реализации схема наклонного сбора данных об одночастичных частицах в крио-ЭМ-экспериментах. Такая процедура особенно полезна для получения высококачественной ЭМ-карты для образцов, страдающих преимущественным смещением ориентации из-за прилипания к границе раздела воздух-вода.

Abstract

Анализ отдельных частиц (SPA) с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в настоящее время является основным методом структурной биологии высокого разрешения. Определение структуры с помощью SPA основано на получении нескольких различных изображений макромолекулярного объекта, остеклованного в тонком слое льда. В идеале совокупность равномерно распределенных ориентаций случайной проекции должна составлять все возможные виды объекта, что приводит к реконструкциям, характеризующимся изотропным направленным разрешением. Однако в действительности многие образцы страдают от предпочтительно ориентированных частиц, прилипших к границе раздела воздух-вода. Это приводит к неравномерным распределениям угловой ориентации в наборе данных и неоднородной выборке в пространстве Фурье при реконструкции, что приводит к отображениям, характеризующимся анизотропным разрешением. Наклон ступени образца обеспечивает обобщаемое решение для преодоления анизотропии разрешения за счет улучшения однородности ориентационных распределений и, следовательно, изотропии дискретизации пространства Фурье. Настоящий протокол описывает стратегию автоматизированного сбора данных с наклонной стадией с использованием Leginon, программного обеспечения для автоматического получения изображений. Процедура проста в реализации, не требует какого-либо дополнительного оборудования или программного обеспечения и совместима с большинством стандартных просвечивающих электронных микроскопов (ПЭМ), используемых для визуализации биологических макромолекул.

Introduction

Появление детекторов прямых электронов за последнее десятилетие ^1,2,3 стимулировало экспоненциальный рост числа структур высокого разрешения макромолекул и макромолекулярных сборок, решаемых с помощью одночастичных крио-ЭМ ^4,5,6. Ожидается, что почти все очищенные макромолекулярные частицы будут поддаваться определению структуры с помощью крио-ЭМ, за исключением мельчайших белков размером ~ 10 кДа или менее⁷. Количество исходного материала, необходимого для подготовки сетки и определения структуры, по крайней мере, на порядок меньше, чем у других методов определения структуры, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса и рентгеновская кристаллография ^4,5,6.

Тем не менее, основная проблема для определения структуры с помощью крио-ЭМ связана с подходящей подготовкой сетки для визуализации. Обширное исследование, оценивающее различные образцы с использованием различных стратегий и сеток витрификации, показало, что большинство подходов к витрификации образцов на крио-электромагнитных сетках приводят к преимущественному присоединению макромолекул к границе раздела^{воздух-вода 8}. Такая приверженность потенциально может привести к четырем неоптимальным результатам: (1) макромолекулярный образец полностью денатурирует, и в этом случае успешный сбор и обработка данных невозможны; (2) образец частично денатурируется, и в этом случае можно получить структурную информацию из областей макромолекулы, которые не повреждены; (3) образец сохраняет нативную структуру, но на изображениях представлен только один набор ориентаций частиц относительно направления электронного пучка; (4) образец сохраняет нативную структуру, и некоторые, но не все возможные ориентации частиц относительно направления электронного пучка представлены на изображениях. Для случаев (3) и (4) наклонный сбор данных поможет свести к минимуму анизотропию направленного разрешения, влияющую на реконструированную крио-ЭМ-карту, и обеспечит обобщаемое решение для широкого спектра образцов⁹. С технической точки зрения, наклон также может принести пользу в случае (2), поскольку денатурация, по-видимому, происходит на границе раздела воздух-вода и аналогичным образом ограничивает количество различных ориентаций, представленных в данных. Степень смещения ориентации в наборе данных потенциально может быть изменена путем экспериментов с добавками раствора, но отсутствие широкой применимости препятствует этим подходам методом проб и ошибок. Наклон столика образца на один оптимизированный угол наклона достаточен для улучшения распределения ориентаций за счет изменения геометрии эксперимента⁹ (рис. 1). Из-за геометрической конфигурации предпочтительно ориентированного образца по отношению к электронному пучку для каждого кластера преимущественных ориентаций наклон сетки создает конус углов освещения по отношению к центроиду кластера. Следовательно, это расширяет представления и, следовательно, улучшает дискретизацию пространства Фурье и изотропию направленного разрешения.

На практике есть некоторые недостатки в наклоне сцены. Наклон предметного столика образца приводит к градиенту фокусировки по всему полю зрения, что может повлиять на точность оценки функции переноса контраста (CTF). Сбор данных под наклоном также может привести к увеличению движения частиц, вызванного пучком, вызванным усилением эффектов зарядки при визуализации наклонных образцов. Наклон сетки также приводит к увеличению кажущейся толщины льда, что, в свою очередь, приводит к более шумным микрофотографиям и может в конечном итоге повлиять на разрешение реконструкций 5,9,10. Эти проблемы можно преодолеть, применяя передовые схемы обработки вычислительных данных, которые кратко описаны в разделах, посвященных протоколу и обсуждению. Наконец, наклон может привести к увеличению перекрытия частиц, что затруднит последующую обработку изображений. Хотя это можно в некоторой степени смягчить, оптимизировав концентрацию частиц на сетке, это, тем не менее, важное соображение. Здесь описан простой в реализации протокол для наклонного сбора данных с использованием программного пакета Leginon (программное обеспечение для автоматического получения изображений), доступного в открытом доступе и совместимого с широким спектром микроскопов^11,12,13,14. Для этого метода требуется как минимум версия 3.0 или выше, а версии 3.3 и более поздние версии содержат специальные улучшения для включения наклонного сбора данных. Для этого протокола не требуется никакого дополнительного программного обеспечения или оборудования. Подробные инструкции по вычислительной инфраструктуре и руководства по установке приведены в других разделах¹⁵.

Protocol

1. Пробоподготовка Используйте сетки, содержащие золотую фольгу и золотую опору16 сетки (см. Таблицу материалов), поскольку сбор данных под наклоном может усилить движение, вызванное лучом17.ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования обра?…

Representative Results

DPS в дозе 0,3 мг/мл использовался для демонстрации визуализации при наклонах 0°, 30° и 60°. Данные с разных углов наклона были собраны на одной и той же сетке в разных областях сетки. Разрешение CTF подходит для более высоких угловых наклонов, как правило, хуже, как это было при сравнении трех на…

Discussion

Предпочтительная ориентация частиц, обусловленная прилипанием образца к границе раздела воздух-вода, является одним из последних серьезных узких мест для рутинного определения структуры с высоким разрешением с использованием крио-ЭМ SPA ^4,5,6<sup class="…

Materials

Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01