हमने पहले क्रमशः बड़े पैमाने पर और अंतरिक्ष प्रशिक्षण द्वारा लघु और दीर्घकालिक सहयोगी यादें बनाने के लिए केनोरहाब्डिस एलिगेंस के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं। यहां, प्रतिकूल सहयोगी स्मृति बनाने के लिए क्रमशः 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड को वातानुकूलित और वातानुकूलित उत्तेजनाओं के रूप में जोड़कर सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस अपने तंत्रिका तंत्र की सादगी के कारण आणविक और सेलुलर स्तरों पर सीखने और स्मृति का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है, जिसके रासायनिक और विद्युत वायरिंग आरेख पूरी तरह से पतले वर्गों के सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से पुनर्निर्मित किए गए थे। यहां, हम क्रमशः अल्पकालिक मेमोरी (एसटीएम) और दीर्घकालिक मेमोरी (एलटीएम) के गठन के लिए बड़े पैमाने पर और स्पेस्ड प्रशिक्षण द्वारा सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। क्रमशः वातानुकूलित और वातानुकूलित उत्तेजनाओं के रूप में 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड को जोड़कर, सी एलिगेंस को प्रतिकूल सहयोगी एसटीएम और एलटीएम बनाने के लिए सफलतापूर्वक प्रशिक्षित किया गया था। जबकि भोले जानवर 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित थे, प्रशिक्षित जानवर अब 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं थे या बहुत कमजोर रूप से आकर्षित नहीं थे। एप्लिसिया और ड्रोसोफिला जैसे अन्य जीवों की तरह, “सीखने और स्मृति जीन” स्मृति निर्माण में आवश्यक भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, एनएमडीए-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, सी एलिगेंस में इंटरन्यूरॉन के केवल छह जोड़े में व्यक्त किए जाते हैं, एसटीएम और एलटीएम दोनों के गठन के लिए आवश्यक हैं, संभवतः एक संयोग कारक के रूप में। इसलिए, मेमोरी ट्रेस इंटरन्यूरॉन के बीच रह सकता है।
जानवरों के लिए सीखने और स्मृति महत्वपूर्ण हैं ताकि वे बदलते वातावरण को कुशलतापूर्वक नेविगेट करके जीवित रहें और प्रजनन करें। एलिगेंस अपने तंत्रिका तंत्र की सादगी के कारण आणविक और सेलुलर स्तरों पर सीखने और स्मृति का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है, जिसके रासायनिक और विद्युत तारों के आरेखों को पतले खंड 1,2,3 के सीरियल इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ से पूरी तरह से पुनर्निर्मित किया गया था।
एलिगेंस खेती के तापमान को भुखमरी के साथ जोड़ना सीखता है और कई घंटोंतक चलने वाली प्रतिकूल स्मृति के साथ इसके विकास तापमान से दूर चला जाता है। भोजन की अनुपस्थिति में सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के साथ कंडीशनिंग सी एलिगेंस एनएसीएल 6,7,8 की ओर केमोटैक्सिस में कमी की ओर जाता है। जब भोजन के साथ जोड़ा जाता है, तो 9,10,11 सीखने के परिणामस्वरूप ब्यूटेनोन आकर्षण बढ़ जाता है। यद्यपि इन घटनाओं को सहयोगी सीखने और स्मृति10,12 के रूप में व्याख्या की जाती है, सहयोगी सीखने और गैर-सहयोगी संवेदीकरण, आदत और अनुकूलन के बीच अंतर सी एलिगेंस सीखने और स्मृति प्रतिमान13,14 में स्पष्ट नहीं है। दरअसल, ब्यूटानोन और भोजन की कमी (प्रतिकूल कंडीशनिंग) के साथ वातानुकूलित जानवरों ने एआईए इंटरन्यूरॉन सहित अन्य न्यूरॉन्स से इंसुलिन संकेतों द्वारा न्यूरॉन्स को लक्षित करने के लिए ब्यूटानोन संवेदी न्यूरॉन एडब्ल्यूसीओएन के उदास युग्मन को दिखाया, जबकि ब्यूटानोन और भोजन (एपेटिटिव कंडीशनिंग) के साथ वातानुकूलित जानवरों ने न्यूरॉन्सको लक्षित करने के लिए एडब्ल्यूसीओएन के बढ़े हुए युग्मन को दिखाया। . इंसुलिन सिग्नलिंग परमाणु ईजीएल -4 और अन्य ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों16,17 द्वारा प्रेरित जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का कारण बनता है। इस प्रकार, इस प्रतिकूल और क्षुधापूर्ण सीखने और स्मृति में क्रमशः गैर-सहयोगी आदत और संवेदीकरण के साथ समानताएं हैं, क्रमशः एप्लिसिया18,19 में गिल-विदड्रॉल रिफ्लेक्स में प्रीसिनेप्टिक संवेदी न्यूरॉन्स की।
वातानुकूलित उत्तेजना (सीएस) और वातानुकूलित उत्तेजना (यूएस) के रूप में दो रसायनों को जोड़कर, हमने और अन्य लोगों ने सी एलिगेंस की कंडीशनिंग के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैंताकि भोजन या भुखमरी का उपयोग किए बिना सहयोगी सीखने और स्मृति का निर्माण किया जा सके। वर्तमान अध्ययन में, प्रोटोकॉल को प्रतिकूल सीखने और अल्पकालिक स्मृति (एसटीएम) और दीर्घकालिक स्मृति (एलटीएम) के लिए क्रमशः सीएस और यूएस के रूप में 1-प्रोपेनोल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल, पीएच 4.0) के साथ जानवरों की स्थिति के लिए संशोधित किया गया है। एलिगेंस 1-प्रोपेनोल 24 द्वारा आकर्षित होता है और एसिड25 द्वारा पीछे हटा दिया जाता है। जब 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) के मिश्रण के साथ वातानुकूलित किया जाता है, तो सी एलिगेंस अब 1-प्रोपेनोल के प्रति आकर्षित नहीं था।
वर्तमान अध्ययन में, सभी अभिकर्मकों को औसतन ~ 18 डिग्री सेल्सियस के आरटी पर रखा गया था, और जानवरों को तनाव से बचने के लिए आरटी में एक बेंच पर जानवरों की खेती की गई थी। जानवरों को शुरू में 20 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में खेती की गई थी और फिर आरटी में अभिकर्मकों का उपयोग करके ~ 24 डिग्री सेल्सियस पर एक बेंच पर वातानुकूलित किया गया था। इन शर्तों के तहत, कंडीशनिंग के परिणाम बहुत परिवर्तनशील थे। एलिगेंस धीरे-धीरे बढ़ता है और 20 डिग्री सेल्सियस से अधिक समय तक खेती की जानी चाहिए जब तक कि जानवर परिपक्व वयस्कता चरण तक नहीं पहुंच जाते, क्योंकि युवा वयस्क जानवर परिपक्व वयस्क जानवरों की तुलना में कंडीशनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले रसायनों के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और कम सीआई मान दिखा सकते हैं।
सफल कंडीशनिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रत्येक रासायनिक उपचार के तुरंत बाद डीडीएच2ओ के साथ जानवरों को धोना है। इसलिए, यांत्रिक और तापमान तनाव को कम से कम किया जाना चाहिए, आरईटी पर अभिकर्मकों को रखकर, और डीडीएच2ओ में पशु कलेक्टर को बहुत धीरे-धीरे ऊपर और नीचे ले जाकर जानवरों को बहुत धीरे से धोना चाहिए। कंडीशनिंग के बाद हर बार जानवरों को पूरी तरह से धोने से सीखने और स्मृति प्रभावित हो सकती है। केमोटैक्सिस परख प्लेटों की स्थितियां भी परिणामों को गंभीर रूप से प्रभावित करती हैं। बहुत सूखी या बहुत गीली प्लेटें जानवरों की चिकनी हरकत को रोकती हैं। चरण 1 में वर्णित प्लेटों को तैयार किया गया था; एक अच्छी प्लेट वह है जिसके लिए डीडीएच2ओ या 5% जलीय 1-प्रोपेनोल के 4 μL धब्बे स्पॉटिंग के लगभग 5 मिनट में एगर द्वारा पूरी तरह से अवशोषित हो जाते हैं। जैसा कि ऊपर वर्णित है, सफल कंडीशनिंग के लिए पशु आयु भी महत्वपूर्ण है। युवा वयस्क जानवर यांत्रिक और रासायनिक उपचार के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तनीय परिणाम होते हैं, हालांकि बहुत वृद्ध जानवर कंडीशनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।
1-प्रोपेनोल की शेल्फ लाइफ ब्रांडों और लॉट पर निर्भर करती है और आरटी में 3 महीने से कम है। जब भोले जानवरों के सीआई मान खराब हो जाते हैं, तो कंडीशनिंग और केमोटैक्सिस परख के लिए ताजा 1-प्रोपेनोल का उपयोग करने की सिफारिश की जाएगी।
बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा स्मृति का गठन अनुवाद अवरोधकों (साइक्लोहेक्सिमाइड और एनिसोमाइसिन) और एक प्रतिलेखन अवरोधक (एक्टिनोमाइसिन डी) के साथ जानवरों के उपचार से प्रभावित नहीं था, जबकि स्पेस्ड प्रशिक्षण द्वारा स्मृति का गठन अवरोधक20,21 द्वारा स्पष्ट रूप से बाधित था। इसके अलावा, पूर्व स्मृति ठंड के झटके से क्षय हो गई, जबकि बाद वाले को पूर्व की तुलना में लंबे समय तक बनाए रखा गया था और ठंडे झटके के लिए प्रतिरोधी था। इन परिणामों से पता चलता है कि पूर्व एसटीएम है और बाद वाला एलटीएम है, क्रमशः20,21। हालांकि, बड़े पैमाने पर प्रशिक्षण द्वारा बनाई गई स्मृति में एसटीएम और मध्य-अवधि (मध्यवर्ती-अवधि) स्मृति शामिल हो सकती है क्योंकि एसटीएम सीआरईबी प्रतिलेखन कारक (चित्रा 5 ए) पर कमजोर रूप से निर्भर है। यह इस परिणाम के अनुरूप है कि एसटीएम को 1 घंटे20,21 से अधिक समय तक बनाए रखा गया था। एसटीएम और एलटीएम दोनों का गठन एनएमआर -1 पर अत्यधिक निर्भर है, जो सी एलिगेंस27,28 में न्यूरॉन्स (एवीए, एवीडी, एवीई, आरआईएम, एवीजी और पीवीसी) के केवल छह जोड़े में व्यक्त किया जाता है। इन न्यूरॉन्स में, इसलिए, एनएमडीए रिसेप्टर्स सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के लिए 1% जलीय 1-प्रोपेनोल और एचसीएल (पीएच 4.0) संकेतों के आणविक संयोग डिटेक्टर के रूप में कार्य कर सकते हैं, जहां एसटीएम और एलटीएम दोनों के लिए आवश्यक सिनैप्टिक मजबूती पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक न्यूरॉन्स 29,30,31,32,33 के संयोग फायरिंग के परिणामस्वरूप हो सकती है। इसलिए, प्रतिकूल सहयोगी स्मृति इंटरन्यूरॉन के बीच बन सकती है।
वर्तमान अध्ययन में वर्णित विधियों को सीएस के रूप में 1-नॉननोल और यूएस21 के रूप में पोटेशियम क्लोराइड का उपयोग करके क्षुधा घ्राण सीखने और अल्पकालिक और दीर्घकालिक सहयोगी स्मृति के लिए लागू होना चाहिए। न्यूरोनल सर्किट की तुलना करना दिलचस्प है जो क्षुधाऔर प्रतिकूल यादों के गठन में शामिल हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि पर उनकी तकनीकी सहायता और टिप्पणियों के लिए ताकाशी मुरायामा, ई-इचिरो सैता, इउ वेन चांग और हितोमी ओहताकी के आभारी हैं। उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्सेज (एनसीआरआर) द्वारा वित्त पोषित किया गया है। इस काम को ओकिनावा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ग्रेजुएट यूनिवर्सिटी से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
Incubator | SANYO | MIR-553 | |
Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tooth picks | |||
Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |