ミツバチ組織における組織学の基礎と細胞死検出
Summary
免疫組織化学的方法は、成虫のミツバチの中腸および下咽頭腺におけるアポトーシスおよび壊死のレベルを検出および評価するためのミツバチの研究において有用である。
Abstract
ミツバチ(Apis mellifera L.)ハイブ内(ナースワーカーや他のハイブミツバチ)とハイブ外(採餌者)は、気候や天候の変化、さまざまな農薬、病原体、栄養失調にさらされ、主に口から侵入し、主に成虫の消化管に影響を与えます。このような外部および内部のストレッサーがミツバチに及ぼす影響を理解し、予防するために、有用な研究方法の1つが免疫組織化学的方法です。組織学的分析のために成体ミツバチの中腸(心室)および下咽頭腺(HPG)を準備するための基本的なプロトコルが説明されています。細胞損傷のレベルを評価し、組織再生の自然なプロセスとして壊死とプログラム細胞死(アポトーシス)を区別するための詳細な方法論が説明されています。シュウ酸と農薬(殺虫剤と殺ダニ剤)による成虫ミツバチの治療結果と、心室とHPGの細胞死の測定が提示されています。方法論の長所と短所についても説明します。
Introduction
ミツバチ(Apis mellifera L.)は、他の野生の花粉媒介者の中でも、農業用植物の最も重要な花粉媒介者です。何千年もの間、変化する環境は、ミツバチが形態、生理学、行動、およびいくつかの病原体や寄生虫に対する耐性を適応させるように影響を与えてきました。したがって、ミツバチは世界中で非常に多様な種と亜種を開発しました1。これらの結果は、ミツバチの消化管構造に遺伝的変異があるという以前の発見と一致していますが、中腸の変化は環境要因によるものであることも示唆しています2,3。
ミツバチの消化管には、前腸、中腸(心室)、後腸4の3つの主要部分があります。心室は花粉と蜜/蜂蜜の消化に不可欠な器官です。後腸では、浸透圧制御は水とイオンの吸収によって行われます2。ミツバチ労働者の下咽頭腺(HPG)は頭にあり、ローヤルゼリー成分を合成して分泌し、ひな、女王、およびコロニーのメンバーに餌を与えます。それらのサイズは年齢や課題によって変化し、適切な栄養(高品質の花粉)に依存します。6〜18日齢の看護師がひなの飼育を行い、HPGのサイズは5,6増加します。採餌ミツバチでは、HPGは変性し、蜂蜜中の複雑な糖を単純な糖(α-グルコシダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、インベルターゼ)に変換するのに重要な酵素のみを分泌します7。
ミツバチはいくつかの生物的および非生物的ストレッサーにさらされており8、消化管はいくつかの負の覚醒剤の影響を受ける可能性があります。病原体から生物を保護する最初の障壁は、病原体から保護するための腸粘膜からなる中腸の周栄養膜です4。HPGの発生と機能は、食事、年齢、コロニーの状態9に依存し、殺虫剤、殺ダニ剤10、および病原体11、12、13の影響を受けます。バロア防除処理および環境からの農薬による巣箱内の殺ダニ剤残留物は、採餌蜂およびナースミツバチに影響を及ぼす14,15。ミツバチのコロニーに対する最大の脅威は、コロニーの損失に寄与するウイルスのベクターとして、また宿主の脂肪体(ミツバチの重要な重要な器官)の消費者として、ダニVarroaデストラクタであり、その結果、個体の体とコロニーの機能に影響を与えます17。
しかし、集中的な農地の生息地は、ミツバチに短期的な食料供給を提供することができます。したがって、農業環境計画は、農業景観における蜂蜜の花の利用可能性を高めるはずです18。異なる亜種6,19,20,21の形態、または細胞または組織レベル、特に中腸およびHPGでのこれらの因子の亜致死的影響を評価するために、組織学的および免疫組織化学的方法は実用的であり、ミツバチの組織学研究に使用するのに十分正確です。
Protocol
1. ミツバチ研究のための基礎組織学 ミツバチ組織の解剖注意: 働きバチの解剖には、LED光源を備えた解剖顕微鏡を使用してください。最も有用な倍率は~20倍です。操作と解剖働きバチを鉗子で慎重に取り、氷の上(または-20°Cの冷凍庫)に2分間入れて固定します22。ペトリ皿に蜂を胸部の背中の上部から左から右、右から左に2回斜めに固定?…
Representative Results
中腸における細胞死の検出リュブリャナのスロベニア農業研究所の実験養蜂場から新たに出現した働きバチ(Apis mellifera carnica)を、3%シュウ酸(OA)23で個別に処理しました。OAは、 Varroaデストラクタ 制御のための養蜂に頻繁に使用されます。処理後、働きバチ(各群から3匹)を氷上に固定した。中腸を解剖し、10%ホルマリンで固定した。次に、組織を?…
Discussion
生体では、細胞死はアポトーシスまたは壊死25として定義され、オートファジー26を伴うことがあります。アポトーシス細胞と壊死細胞の違いは、アポトーシスはプログラムされた細胞死の一形態であり、正常細胞に現れるのに対し、壊死は致命的な状態(事故、病気など)によって起こることです27,28。アポトーシ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スロベニア研究庁、助成金番号P4-133の支援に感謝します。
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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Cite This Article
Smodiš Škerl, M. I. Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64141, doi:10.3791/64141 (2022).