Recolección y mantenimiento a largo plazo de hormigas cortadoras de hojas (Atta) en condiciones de laboratorio

Summary

Aquí, se describe un protocolo para recolectar y mantener con éxito colonias sanas de hormigas Atta (Hymenoptera: Formicidae) en condiciones de laboratorio. Además, se detallan diferentes tipos y configuraciones de nidos junto con posibles procedimientos experimentales.

Abstract

Las hormigas son uno de los grupos de animales con mayor biodiversidad del planeta y habitan en diferentes entornos. El mantenimiento de colonias de hormigas en ambientes controlados permite una comprensión enriquecida de su biología que puede contribuir a la investigación aplicada. Esta práctica se emplea generalmente en estudios de control de poblaciones de especies que causan pérdidas económicas, como las hormigas Atta . Para cultivar su hongo mutualista, estas hormigas cortadoras de hojas recolectan hojas y para ello se consideran plagas agrícolas ampliamente distribuidas por todo el continente americano. Están altamente organizados socialmente y habitan nidos subterráneos elaborados compuestos por una variedad de cámaras. Su mantenimiento en un ambiente controlado depende de una rutina diaria de varios procedimientos y cuidados frecuentes que se describen aquí. Comienza con la recolección de reinas durante la temporada reproductiva (es decir, el vuelo nupcial), que luego se transfieren individualmente a recipientes de plástico. Debido a la alta tasa de mortalidad de las reinas, se puede realizar una segunda recolección unos 6 meses después del vuelo nupcial, cuando los nidos incipientes con fajo de hongos desarrollados se excavan, se recogen a mano y se colocan en recipientes de plástico. En el laboratorio, las hojas se proporcionan diariamente a las colonias establecidas, y los desechos producidos por hormigas se eliminan semanalmente junto con el material vegetal seco restante. A medida que el jardín de hongos sigue creciendo, las colonias se transfieren a diferentes tipos de contenedores de acuerdo con el propósito experimental. Las colonias de hormigas cortadoras de hojas se colocan en contenedores interconectados, que representan el sistema organizativo con cámaras funcionales construidas por esos insectos en la naturaleza. Esta configuración es ideal para monitorear factores como la cantidad de desechos, la salud del jardín de hongos y el comportamiento de las obreras y la reina. La recopilación de datos facilitada y las observaciones más detalladas se consideran la mayor ventaja de mantener las colonias de hormigas en condiciones controladas.

Introduction

Las hormigas componen un grupo diverso de individuos que ejercen una influencia en la mayoría de los ambientes terrestres¹. Actúan como dispersores eficientes ^2,3,4, depredadores⁵ e ingenieros de ecosistemas 6,7,8,9,10^, destacando su importancia y éxito ecológico en los ecosistemas naturales. Todas las especies de hormigas se clasifican como insectos eusociales; Sin embargo, su organización social varía mucho entre los diferentes grupos de especies, es decir, los sistemas de división del trabajo, los grupos funcionales, la comunicación entre individuos, la organización del forraje, la fundación de colonias y el proceso de reproducción¹¹. Como grupo altamente diversificado, recurren a varios recursos alimenticios y comportamientos de alimentación especializados. De hecho, la agricultura no solo fue un gran paso para la civilización humana, sino también para las especies de hormigas. Hace aproximadamente 55 a 65 Ma¹², las hormigas attine comenzaron a cultivar hongos e incorporarlos a una dieta casi exclusiva. Se especializaron tanto que desarrollaron interacciones estrictas, dependientes y obligatorias clasificadas como simbiosis, donde un individuo no sobrevive sin el otro.

Las hormigas productoras de hongos inferiores recolectan y procesan materia orgánica muerta, como fragmentos de hojas podridas, para cultivar su hongo mutualista; mientras que las hormigas productoras de hongos más altas cosechan material vegetal fresco, componiendo uno de los sistemas naturales simbióticos más exitosos¹³. Esta técnica agrícola altamente especializada les permitió aprovechar un nuevo nicho. Las hormigas attine más altas comprenden las hormigas cortadoras de hojas, un grupo monofilético que despierta entre 19 Ma (15-24 Ma) y 18 Ma (14-22 Ma)^14,15,16 que consiste en cuatro géneros válidos: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr^, Amoimyrmex Cristiano y Pseudoatta Gallardo. El sistema de agricultura cortadora de hojas realizado por las hormigas cortadoras de hojas, evolucionó a partir de sistemas agrícolas derivados¹⁷. La mayoría de estas especies explotan exclusivamente la especie de hongo mutualista Leucoagaricus gongylophorus Singer 18 (también llamada Leucocoprinus gongylophorus Heim¹⁹), marcando una transición evolutiva significativa¹¹. Los cultivares fúngicos se transmiten verticalmente, desde los nidos originales hasta las crías, lo que sugiere que se propagan clonalmente²⁰.

Sorprendentemente, las sociedades Atta desarrollaron una estructura organizativa compleja de enorme importancia en su entorno y de gran interés para los mirmecólogos. Su población puede estar compuesta por millones de individuos, la mayoría de ellos trabajadoras estériles que muestran un polimorfismo acentuado, es decir, tamaño y morfología anatómica distintos. La población se distingue por castas según edad, estado fisiológico, tipo morfológico, comportamientos y actividades especializadas en la colonia²¹. Los trabajadores pueden ser discriminados en jardineros y enfermeras, generalistas dentro del nido, recolectores y excavadores, y defensores o soldados²¹. Esta organización permite la realización de tareas en cooperación y un sistema de autoorganización que puede producir comportamientos colectivos altamente estructurados, permitiéndoles responder eficientemente a las perturbaciones ambientales²².

El papel de renovación de la población es desempeñado por una sola reina (es decir, monógina), mientras viva, constituyendo la casta reproductiva permanente²². Se sabe que las reinas Atta viven más de 20 años, poniendo huevos a lo largo de su vida²³. Como la reina es insustituible, su resistencia es crucial para la supervivencia de la colonia ^13,20,23,24. Sin embargo, miles de hembras y machos reproductores alados se pueden encontrar en el nido durante las temporadas de reproducción, pero ninguno permanece en el nido original, formando una casta temporal²². En las colonias de Atta sexdens, se producen cerca de 3.000 hembras reproductoras y 14.000 machos reproductivos²⁵. Ocurre cuando una colonia alcanza la madurez sexual, aproximadamente 38 meses desde su implementación, y se repite anualmente desde entonces hasta que se extingue^23,25. Las nuevas colonias de Atta se establecen a través de la haplometrosis, donde una reina comienza un nuevo nido.

Cuando las condiciones ambientales son favorables, los reproductores abandonan el nido subterráneo para comenzar el vuelo nupcial. El período de su ocurrencia difiere según la región, variando a lo largo del año en todo el territorio brasileño dependiendo de la especie. Sin embargo, el evento parece estar precedido por lluvias y humedad elevación²⁶, que puede estar relacionada con la facilitación de la excavación debido a la humedad del suelo²². Con frecuencia, 1-5 semanas antes del vuelo nupcial, las entradas y los canales de los nidos se ensanchan para facilitar la salida de los individuos reproductivos. Antes de abandonar sus colonias madre, las hembras aladas recogen y almacenan, en una cavidad infrabucal, una porción del hongo mutualista^20,27. Se realizan cópulas múltiples en pleno vuelo, y se calcula que una reina puede ser inseminada por tres a ocho machos (es decir, poliandria) en algunas especies²⁸, asegurando la variabilidad genética²⁹. Después, las reinas proceden al suelo, dando preferencia a lugares con poca o ninguna vegetación²⁵, donde quitan sus alas y excavan su primera cámara de anidación. Este es el único período en el que se pueden ver reinas fuera del nido. A pesar de que individuos de la casta temporal fueron vistos en nidos artificiales, se desconoce si alguna cópula exitosa (es decir, vuelo nupcial) fue realizada en condiciones de laboratorio²⁴.

La construcción inicial del nido corresponde al período más crucial de la colonia, que puede durar de 6 h a 8 h^23,25. En este momento, la reina se enclaustra en la cámara inicial, y en cuestión de días, comienza la oviposición. Los primeros huevos se alimentan al micelio que la reina regurgita, marcando el inicio del jardín de hongos de la colonia. Las primeras larvas aparecen en aproximadamente 25 días²², y casi al final del primer mes, la colonia consiste en una estera de hongos proliferantes, donde se anidan los inmaduros (huevos, larvas y pupas), y la reina, que cría a su descendencia inicial en aislamiento²³. Los huevos también son el recurso alimenticio de las primeras larvas y muy consumidos por la reina¹³. Además, la reina se sostiene con reservas corporales grasas y catabolizando los músculos de las alas que ya no son útiles¹³. El cultivo inicial de hongos no se consume ya que la supervivencia de la colonia depende de su desarrollo, y durante este período, la reina la fertiliza con líquido fecal¹³. Días después de emerger, las primeras obreras abren la entrada del nido y comienzan una actividad de forrajeo en el área inmediata del nido¹³. Incorporan el material recolectado como sustrato del jardín de hongos, que ahora está sirviendo como alimento para los trabajadores ^13,22. Antes de ser agregado al cultivo de hongos, el material vegetal transportado por los trabajadores se corta en trozos pequeños y se humedece con líquido fecal¹³. Las hormigas manipulan el inóculo del hongo para aumentar y controlar su crecimiento, lo que servirá para dividir grandes cámaras excavadas de tierra, especializadas en acondicionar el jardín 13,22,25.

Aproximadamente 6 meses después del vuelo nupcial, los nidos de A. sexdens contienen una cámara de hongos y algunos canales. La gran especialización en la construcción de nidos de hormigas cortadoras de hojas funciona como un mecanismo de defensa contra enemigos naturales y factores ambientales desfavorables²². Se sabe que las hormigas cortadoras de hojas fragmentan el jardín de hongos y lo transponen a cámaras con alta humedad cuando las cámaras comienzan a secarse¹³. Así, a pesar de que la excavación del nido tiene un costo energético considerable, la energía invertida se invierte en beneficios para la propia colonia²². Con algunas excepciones, las especies de Atta también hacen cámaras especializadas para los desechos de la colonia, hechas principalmente de sustrato de hongo agotado y cuerpos de hormigas muertas, aislándola del resto del nido y estableciendo una importante estrategia de inmunidad social³⁰. Además, un grupo distinto de trabajadores manipula la basura directamente, para evitar la contaminación de otros individuos. Las obreras se alimentan constantemente para nutrir el hongo, que es el principal recurso nutricional de la colonia. Sin embargo, también pueden alimentarse de la savia de la planta mientras cortan fragmentos. El material vegetal es cuidadosamente seleccionado para el mantenimiento del jardín de hongos e influenciado por muchos factores, como los rasgos de las hojas y las propiedades del ecosistema¹³.

La estrategia de forrajeo de las hormigas cortadoras de hojas para obtener material fresco es altamente compleja, y combinada con la alta demanda de cosecha de las colonias establecidas, resulta en una pérdida económica considerable para los productores agrícolas y pone en peligro las áreas de restauración forestal^22,31. Por lo tanto, estas hormigas pueden clasificarse como plagas en la mayoría de las áreas donde se pueden encontrar, desde el sur de los Estados Unidos hasta el noreste de Argentina 11,13,22,32. La extinción de colonias problemáticas es un desafío debido a la serie de adaptaciones inherentes a la biología de estos insectos (es decir, organización social, búsqueda de alimento, cultivo de hongos, higiene y estructuras complejas de nidos)³³. Así, las estrategias de control poblacional son distintas de las generalmente aplicadas a otras plagas de insectos, y recurren principalmente a atractivas ofertas de cebo contaminado^33,34. Sin embargo, como estas hormigas pueden rechazar sustancias nocivas tanto para el hongo como para los individuos de la colonia, y comprometer los campos cultivados 33, constantemente se prueban nuevos compuestos naturales y alternativas de control^33,35,36. Como los resultados de los experimentos difícilmente pueden ser monitoreados en colonias probadas en el campo, los ensayos preliminares se llevan a cabo en un ambiente controlado.

Por lo tanto, los protocolos experimentales deben adaptarse a los grupos de interés considerando el estilo de vida heterogéneo de las hormigas, apoyando estudios a nivel de especie y teniendo en cuenta las colonias como unidades operativas, donde una hormiga es un elemento de un superorganismo complejo¹¹. Los informes recopilados hasta ahora sobre el género Atta permitieron recolectar y mantener con éxito colonias en condiciones de laboratorio y reconocer sus necesidades básicas y su funcionamiento general. A partir de sus procesos naturales como la reproducción, la fundación de colonias y los comportamientos de alimentación, se ha desarrollado una rutina de prácticas que permite el establecimiento a largo plazo de colonias en diferentes tipos de nidos. Aquí, se describe un protocolo de procedimiento para mantener a las hormigas cortadoras de hojas en el laboratorio y destaca la posible investigación general con distintos propósitos de experimentación y divulgación científica.

Protocol

1. Colección de reinas Buscar en la literatura el período de la temporada reproductiva de Atta en la región de interés. La ocurrencia de la temporada reproductiva, la frecuencia y el horario diurno de los vuelos nupciales, varía de acuerdo con las condiciones climáticas regionales (Tabla 1). Aunque generalmente se lleva a cabo en primavera, esta información debe recopilarse para el lugar donde se pretende que ocurra la recolección 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46….

Representative Results

En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo que representa el proceso de recolección de hormigas. Aquí se muestran algunos resultados obtenidos empleando el protocolo de recolección, mantenimiento y configuraciones de anidación descritas anteriormente. Figura 6: Diagrama de flujo para la recol…

Discussion

El protocolo descrito aquí para mantener colonias de hormigas cortadoras de hojas se ha desarrollado y aplicado durante más de tres décadas de manera asertiva y replicable. Permitió el desarrollo de investigaciones que estarían limitadas por las condiciones del campo. De este modo, las hormigas sanas y las colonias estuvieron disponibles para la investigación en varias áreas, como la morfología comparada, la toxicología 51,52, la histología⁵³ y la microbiología^54,55,56…

Materials

Entomologic forceps	N/A	N/A	N/A
Glass tank	N/A	N/A	Tempered glass, custom made
Hose	N/A	N/A	Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves	Descarpack	550301	N/A
Nitrile gloves	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Polypropylene crate
Plaster pouder	N/A	N/A	Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection	Prafesta	Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262	Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests	Prafesta	Discontinued	Polystyrene, hermetic
Teflon	Dupont	N/A	Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)