Verzameling en langdurig onderhoud van bladsnijdende mieren (Atta) in laboratoriumomstandigheden

Summary

Hier wordt een protocol beschreven om met succes gezonde Atta (Hymenoptera: Formicidae) mierenkolonies te verzamelen en te onderhouden in laboratoriumomstandigheden. Bovendien worden verschillende nesttypen en configuraties gedetailleerd samen met mogelijke experimentele procedures.

Abstract

Mieren zijn een van de meest biodiverse groepen dieren op de planeet en bewonen verschillende omgevingen. Het onderhoud van mierenkolonies in gecontroleerde omgevingen maakt een verrijkt begrip van hun biologie mogelijk dat kan bijdragen aan toegepast onderzoek. Deze praktijk wordt meestal gebruikt in populatiecontrolestudies van soorten die economisch verlies veroorzaken, zoals Atta-mieren . Om hun mutualistische schimmel te cultiveren, verzamelen deze bladsnijmieren bladeren en worden hiervoor beschouwd als landbouwplagen die wijd verspreid zijn over het Amerikaanse continent. Ze zijn zeer sociaal georganiseerd en bewonen uitgewerkte ondergrondse nesten die bestaan uit een verscheidenheid aan kamers. Hun onderhoud in een gecontroleerde omgeving hangt af van een dagelijkse routine van verschillende procedures en frequente zorg die hier worden beschreven. Het begint met het verzamelen van koninginnen tijdens het voortplantingsseizoen (d.w.z. huwelijksvlucht), die vervolgens individueel worden overgebracht naar plastic containers. Vanwege het hoge sterftecijfer van koninginnen, kan een tweede verzameling ongeveer 6 maanden na de huwelijksvlucht worden uitgevoerd, wanneer beginnende nesten met ontwikkeld schimmelwaad worden uitgegraven, met de hand geplukt en in plastic containers worden geplaatst. In het laboratorium worden dagelijks bladeren verstrekt aan gevestigde kolonies en wordt door mieren geproduceerd afval wekelijks verwijderd, samen met het resterende droge plantmateriaal. Naarmate de schimmeltuin blijft groeien, worden kolonies overgebracht naar verschillende soorten containers volgens het experimentele doel. Bladsnijdende mierenkolonies worden in onderling verbonden containers geplaatst, die het organisatiesysteem vertegenwoordigen met functionele kamers gebouwd door die insecten in de natuur. Deze opstelling is ideaal om factoren zoals afvalhoeveelheid, schimmeltuingezondheid en het gedrag van werknemers en koninginnen te controleren. Gefaciliteerde gegevensverzameling en meer gedetailleerde observaties worden beschouwd als het grootste voordeel van het houden van mierenkolonies in gecontroleerde omstandigheden.

Introduction

Mieren vormen een diverse groep individuen die invloed uitoefenen op de meeste terrestrische omgevingen¹. Ze fungeren als efficiënte verspreiders ^2,3,4, roofdieren⁵ en ecosysteemingenieurs ^6,7,8,9,10, wat hun belang en ecologisch succes op natuurlijke ecosystemen benadrukt. Alle mierensoorten zijn geclassificeerd als eusociale insecten; hun sociale organisatie varieert echter sterk tussen verschillende soortengroepen, d.w.z. arbeidsverdelingssystemen, functionele groepen, communicatie tussen individuen, voederorganisatie, koloniestichting en reproductieproces¹¹. Als een zeer gediversifieerde groep nemen ze hun toevlucht tot verschillende voedselbronnen en gespecialiseerd voedingsgedrag. In feite was landbouw niet alleen een enorme stap voor de menselijke beschaving, maar ook voor mierensoorten. Ongeveer 55 tot 65 Ma geleden¹², attine mieren begonnen schimmels te kweken en op te nemen in een bijna exclusief dieet. Ze werden zo gespecialiseerd dat ze strikte, afhankelijke en verplichte interacties ontwikkelden die geclassificeerd werden als symbiose, waarbij het ene individu niet overleeft zonder het andere.

Lagere schimmelgroeiende mieren verzamelen en verwerken dood organisch materiaal, zoals fragmenten van rottend blad, om hun mutualistische schimmel te laten groeien; terwijl hogere schimmelgroeiende mieren vers plantmateriaal oogsten, waardoor een van de meest succesvolle symbiotische natuurlijke systemen wordt samengesteld¹³. Deze zeer gespecialiseerde landbouwtechniek stelde hen in staat om een nieuwe niche te veroveren. De hogere attinemieren vormen de bladsnijdende mieren, een monofyletische groep die tussen 19 Ma (15-24 Ma) en 18 Ma (14-22 Ma)14,15,16 opwekt, bestaande uit vier geldige geslachten: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr, Amoimyrmex Cristiano en Pseudoatta Gallardo. Het bladsnijderlandbouwsysteem dat door de bladsnijmieren wordt uitgevoerd, is voortgekomen uit afgeleide landbouwsystemen¹⁷. De meeste van deze soorten exploiteren uitsluitend de mutualistische schimmelsoort Leucoagaricus gongylophorus Singer¹⁸ (ook wel Leucocoprinus gongylophorus Heim¹⁹ genoemd), wat een significante evolutionaire overgang markeert¹¹. De schimmelcultivars worden verticaal overgedragen, van originele nesten tot nakomelingen, wat suggereert dat ze klonaal zijn vermeerderd²⁰.

Opmerkelijk is dat Atta-samenlevingen een complexe organisatiestructuur ontwikkelden die van enorm belang is voor hun omgeving en van groot belang is voor myrmecologen. Hun populatie kan bestaan uit miljoenen individuen, de meesten van hen steriele vrouwelijke werknemers die een geaccentueerd polymorfisme vertonen, d.w.z. verschillende grootte en anatomische morfologie. De populatie onderscheidt zich door kasten op basis van leeftijd, fysiologische toestand, morfologisch type, gedrag en gespecialiseerde activiteiten in de kolonie²¹. Werknemers kunnen worden gediscrimineerd in tuinders en verpleegkundigen, generalisten binnen het nest, foerageurs en graafmachines, en verdedigers of soldaten²¹. Deze organisatie maakt het mogelijk om taken in samenwerking uit te voeren en een zelforganiserend systeem dat zeer gestructureerd collectief gedrag kan produceren, waardoor ze efficiënt kunnen reageren op omgevingsverstoringen²².

De rol van populatievernieuwing wordt gespeeld door een enkele koningin (d.w.z. monogynisch), zolang ze leeft, die de permanente reproductieve kaste vormt²². Van Atta-koninginnen is bekend dat ze meer dan 20 jaar leven en eieren leggen gedurende hun hele levensduur²³. Omdat de koningin onvervangbaar is, is haar uithoudingsvermogen cruciaal voor het voortbestaan van de kolonie 13,20,23,24. Toch zijn duizenden gevleugelde reproductieve vrouwtjes en mannetjes tijdens broedseizoenen in het nest te vinden, maar geen enkele blijft in het oorspronkelijke nest en vormt een tijdelijke kaste²². In Atta sexdens kolonies worden bijna 3.000 reproductieve vrouwtjes en 14.000 reproductieve mannetjes geproduceerd²⁵. Het treedt op wanneer een kolonie geslachtsrijp is, ongeveer 38 maanden na de implementatie ervan, en wordt sindsdien jaarlijks herhaald totdat het^23,25 is uitgedoofd. Nieuwe Atta-kolonies worden gevestigd door haplometrosis, waarbij één koningin een nieuw nest begint.

Wanneer de omgevingsomstandigheden gunstig zijn, verlaten de reproduceerders het ondergrondse nest om de huwelijksvlucht te beginnen. De periode van het voorkomen verschilt per regio, variërend over het hele jaar over het hele Braziliaanse grondgebied, afhankelijk van de soort. De gebeurtenis lijkt echter te worden voorafgegaan door regenval en vochtigheidshoogte²⁶, die kan worden gerelateerd aan het faciliteren van uitgraving als gevolg van bodemvocht²². Vaak worden 1-5 weken voor de huwelijksvlucht nestingangen en kanalen verbreed om de reproductieve individuen te vergemakkelijken om te vertrekken. Voordat ze hun moederkolonies verlaten, verzamelen en bewaren de gevleugelde vrouwtjes in een infrabuccale holte een deel van de mutualistische schimmel^20,27. Meerdere copulaties worden halverwege de vlucht uitgevoerd en er wordt berekend dat één koningin kan worden geïnsemineerd door drie tot acht mannetjes (d.w.z. polyandrie) in sommige soorten²⁸, waardoor genetische variabiliteit wordt gegarandeerd²⁹. Daarna gaan de koninginnen naar de grond en geven ze de voorkeur aan locaties met geen of weinig vegetatie²⁵, waar ze hun vleugels verwijderen en hun eerste nestkamer uitgraven. Dit is de enige periode waarin koninginnen buiten het nest te zien zijn. Hoewel individuen van de tijdelijke kaste werden gezien in kunstmatige nesten, is het onbekend of een succesvolle copulatie (d.w.z. huwelijksvlucht) werd uitgevoerd in laboratoriumomstandigheden²⁴.

De eerste nestbouw komt overeen met de meest cruciale periode van de kolonie, die kan duren van 6 h tot 8 h ^23,25. Op dit moment kloostert de koningin zichzelf in de eerste kamer en binnen enkele dagen begint de ovipositie. De eerste eieren worden gevoerd aan de mycelial die de koningin oprispt, wat het begin van de schimmeltuin van de kolonie markeert. De eerste larven verschijnen in ongeveer 25 dagen²², en bijna aan het einde van de eerste maand bestaat de kolonie uit een mat van woekerende schimmel, waar onvolwassenen (eieren, larven en poppen) zijn genest, en de koningin, die haar eerste nakomelingen in isolatie grootbrengt²³. Eieren zijn ook de voedselbron van de eerste larven en worden sterk geconsumeerd door de koningin¹³. Bovendien onderhoudt de koningin zichzelf met vetlichaamreserves en kataboliserende vleugelspieren die niet langer van nut zijn¹³. De initiële schimmelcultuur wordt niet geconsumeerd omdat de overleving van de kolonie afhankelijk is van de ontwikkeling ervan, en tijdens deze periode bevrucht de koningin het met fecale vloeistof¹³. Dagen nadat ze tevoorschijn zijn gekomen, openen de eerste werksters de nestingang en beginnen ze met een foerageeractiviteit in de directe omgeving van het nest¹³. Ze bevatten het verzamelde materiaal als substraat van de schimmeltuin, die nu dient als voedsel voor de arbeiders^13,22. Voordat het aan de schimmelcultuur wordt toegevoegd, wordt het plantmateriaal dat door de werknemers wordt meegevoerd in kleine stukjes gesneden en bevochtigd met fecale vloeistof¹³. De mieren manipuleren schimmel inoculum om de groei te verhogen en te beheersen, wat zal dienen voor het verdelen van grote grond uitgegraven kamers, gespecialiseerd in het conditioneren van de tuin 13,22,25.

Ongeveer 6 maanden na de huwelijksvlucht bevatten de nesten van A. sexdens een schimmelkamer en een paar kanalen. De grote specialisatie in de bouw van bladsnijdende mierennesten werkt als een verdedigingsmechanisme tegen natuurlijke vijanden en ongunstige omgevingsfactoren²². Van bladsnijmieren is bekend dat ze de schimmeltuin fragmenteren en transponeren naar kamers met een hoge luchtvochtigheid wanneer kamers beginnen uit te drogen¹³. Dus, ondanks het feit dat het uitgraven van het nest een aanzienlijke energiekost heeft, wordt de geïnvesteerde energie omgekeerd in voordelen voor de kolonie zelf²². Op een paar uitzonderingen na maken Atta-soorten ook gespecialiseerde kamers voor het afval van de kolonie, meestal gemaakt van uitgeput schimmelsubstraat en lichamen van dode mieren, isoleren het van de rest van het nest en stellen een belangrijke sociale immuniteitsstrategie vast³⁰. Bovendien manipuleert een afzonderlijke groep werknemers het afval rechtstreeks, om besmetting van andere personen te voorkomen. Arbeiders foerageren voortdurend om de schimmel te voeden, wat de belangrijkste voedingsbron van de kolonie is. Ze kunnen zich echter ook voeden met plantensap tijdens het snijden van fragmenten. Plantmateriaal wordt zorgvuldig geselecteerd voor het onderhoud van de schimmeltuin en beïnvloed door vele factoren zoals bladeigenschappen en eigenschappen van het ecosysteem¹³.

De foerageerstrategie van bladsnijmieren om vers materiaal te verkrijgen is zeer complex en in combinatie met de hoge oogstvraag van gevestigde kolonies resulteert dit in aanzienlijk economisch verlies voor landbouwproducenten en brengt het bosherstelgebieden in gevaar^22,31. Daarom kunnen deze mieren worden gecategoriseerd als ongedierte in de meeste gebieden waar ze kunnen worden aangetroffen, variërend van het zuiden van de Verenigde Staten tot het noordoosten van Argentinië 11,13,22,32. Het uitdoven van problematische kolonies is een uitdaging vanwege de reeks aanpassingen die inherent zijn aan de biologie van deze insecten (d.w.z. sociale organisatie, foerageren, schimmelteelt, hygiëne en complexe neststructuren)³³. Vandaar dat de populatiebeheersingsstrategieën verschillen van die welke over het algemeen worden toegepast op andere insectenplagen en voornamelijk hun toevlucht nemen tot aantrekkelijke besmette aasaanbiedingen^33,34. Omdat deze mieren echter schadelijke stoffen voor zowel de schimmel als de kolonie-individuen kunnen afwijzen en gecultiveerde velden kunnen compromitteren³³, worden nieuwe natuurlijke verbindingen en alternatieven voor bestrijding voortdurend getest 33,35,36. Omdat experimentresultaten nauwelijks kunnen worden gevolgd op in het veld geteste kolonies, worden voorlopige essays uitgevoerd in een gecontroleerde omgeving.

Experimentele protocollen moeten dus worden aangepast aan groepen van belang, rekening houdend met de heterogene levensstijl van mieren, het ondersteunen van studies op soortniveau en het verantwoorden van kolonies als operationele eenheden, waarbij één mier een element is van een complex superorganisme¹¹. De tot nu toe verzamelde rapporten over het geslacht Atta maakten het haalbaar om met succes kolonies in laboratoriumomstandigheden te verzamelen en te onderhouden en hun basisbehoeften en algemeen functioneren te erkennen. Op basis van hun natuurlijke processen zoals voortplanting, het stichten van kolonies en voedingsgedrag, is een routine van praktijken ontwikkeld die het mogelijk maakt om op lange termijn kolonies in verschillende soorten nesten te vestigen. Hier wordt een procedureel protocol beschreven om bladsnijdende mieren in het laboratorium te behouden en belicht mogelijk algemeen onderzoek met verschillende experimenteerdoeleinden en wetenschappelijke outreach.

Protocol

1. Verzameling koninginnen Zoek in de literatuur voor de periode van het atta-voortplantingsseizoen in de regio van belang. Het voorkomen van het voortplantingsseizoen, de frequentie en de dag van huwelijksvluchten varieert afhankelijk van de regionale klimaatomstandigheden (tabel 1). Hoewel het over het algemeen in het voorjaar plaatsvindt, moet deze informatie worden verzameld voor de locatie waar de verzameling bedoeld is 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.<sup class="xr…

Representative Results

Een stroomdiagram dat het proces van mierenverzameling weergeeft, is weergegeven in figuur 6. Hier worden enkele resultaten weergegeven die zijn verkregen met behulp van het protocol van verzameling, onderhoud en nestopstellingen zoals hierboven beschreven. Figuur 6: Stroomdiagram voor het verzamelen…

Discussion

Het hier beschreven protocol om bladsnijgantonen in stand te houden is al meer dan drie decennia op een assertieve en repliceerbare manier ontwikkeld en toegepast. Het maakte de ontwikkeling mogelijk van onderzoek dat zou worden beperkt door veldomstandigheden. Daardoor kwamen gezonde mieren en kolonies beschikbaar voor onderzoek op verschillende gebieden zoals vergelijkende morfologie, toxicologie^51,52, histologie⁵³ en microbiologie 54,55…

Materials

Entomologic forceps	N/A	N/A	N/A
Glass tank	N/A	N/A	Tempered glass, custom made
Hose	N/A	N/A	Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves	Descarpack	550301	N/A
Nitrile gloves	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Polypropylene crate
Plaster pouder	N/A	N/A	Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection	Prafesta	Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262	Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests	Prafesta	Discontinued	Polystyrene, hermetic
Teflon	Dupont	N/A	Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)