インビトロ 模擬胃腸液の多相交換 による 単一液滴中のエマルジョンの消化
Summary
OCTOPUSと呼ばれるマルチサブフェーズ交換で実装されたペンダントドロップサーフェスフィルムバランスは、元のバルク溶液をシミュレートされた胃腸液と順次サブフェーズ交換することにより、消化状態を模倣することができます。シミュレートされた in vitro 消化は、消化された界面層の界面張力を in situ で記録することによってモニターされる。
Abstract
エマルジョンは現在、肥満、栄養強化、食物アレルギー、消化器疾患などのさまざまな胃腸の状態に取り組むための栄養素や薬物をカプセル化して送達するために使用されています。所望の機能性を提供するエマルジョンの能力、すなわち、胃腸管内の特定の部位に到達する、脂肪分解を阻害/遅延させる、または消化性を促進する能力は、最終的には胃腸管における酵素分解に対する感受性に依存する。水中油型エマルジョンでは、脂肪滴は界面層に囲まれており、乳化剤がエマルションを安定化させ、カプセル化された化合物を保護します。エマルジョンのカスタマイズされた消化率を達成するには、初期組成に依存しますが、胃腸消化のさまざまな段階にさらされるにつれて、これらの界面層の進化を監視する必要もあります。マルチサブフェーズ交換で実装されたペンダントドロップサーフェスフィルムバランスにより、カスタマイズされた静的消化モデルを適用することにより、油に浸された単一の水性液滴中のエマルジョンの in vitro 消化をシミュレートできます。胃腸管を通過することは、胃腸管の各コンパートメント/ステップの生理学的条件を模倣して、人工培地との元の液滴バルク溶液のサブフェーズ交換によって模倣されます。界面張力の動的進化は、シミュレートされた胃腸消化全体を通して その場で 記録されます。界面拡張弾性や粘度などの消化界面の機械的特性は、各消化段階(経口、胃、小腸)の後に測定されます。各消化媒体の組成は、胃腸の病状および乳児の消化媒体を含む消化状態の特殊性を説明するように調整することができる。タンパク質分解と脂肪分解に影響を与える特定の界面メカニズムが特定され、エマルジョンの界面工学によって消化を調節するためのツールが提供されます。得られた結果は、低アレルゲン性、制御されたエネルギー摂取量、消化率の低下などのカスタマイズされた機能を備えた新しい食品マトリックスを設計するために操作できます。
Introduction
エマルジョン消化を伴う脂肪の消化方法を理解することは、カスタマイズされた機能性を備えた製品を合理的に設計するために重要です1。脂肪消化の基質は、脂肪が機械的作用によって消費され、口や胃の中でバイオサーファクタントと混合することによって乳化されるため、エマルジョンです。また、人間が消費する脂肪のほとんどはすでに乳化されており(乳製品など)、乳児や一部の高齢者の場合、これが唯一の消費形態です。したがって、特定の消化プロファイルを持つエマルジョンベースの製品の設計は、栄養において非常に重要です1。さらに、エマルジョンは、栄養素、薬物、または親油性生物活性物質2 をカプセル化して送達し、肥満3、栄養強化、食物アレルギー、消化器疾患などのさまざまな胃腸の状態に取り組むことができます。水中油型エマルションにおいて、脂肪滴は、タンパク質、界面活性剤、ポリマー、粒子、および混合物などの乳化剤の界面層によって囲まれている4。乳化剤の役割は2つあります:エマルジョン5 を安定化させ、カプセル化された化合物を特定部位に保護/輸送します。エマルジョンのカスタマイズされた消化率を達成するには、初期組成に依存しますが、胃腸管を通過する間のこの界面の継続的な進化を監視する必要もあります(図1)。
図1:エマルジョンの界面工学を適用して、主要な胃腸の状態のいくつかに取り組む。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
脂質消化は、界面層を介して乳化脂肪滴の油-水界面にリパーゼ(胃または膵臓)を吸着し、油に含まれるトリグリセリドに到達して遊離脂肪酸およびモノアシルグリセリドに加水分解する必要があるため、最終的には界面プロセスです6。これを 図 2 に示します。胃リパーゼは、胃のペプシンやリン脂質と油水界面で競合します(図2、胃の消化)。次に、膵臓リパーゼ/コリパーゼは、小腸のトリプシン/キモトリプシン、リン脂質、胆汁酸塩、および消化産物と競合します。プロテアーゼは界面被覆率を変化させ、リパーゼ吸着を防止または促進することができますが、胆汁酸塩は界面活性が高く、残りの乳化剤の大部分を置換してリパーゼ吸着を促進します(図2、腸管消化)。最終的に、脂肪分解の速度と程度は、厚さ、分子間/分子内接続、静電相互作用と立体相互作用など、初期/胃消化エマルジョンの界面特性に依存します。したがって、消化される界面層の進化をモニタリングすることは、リパーゼ吸着、ひいては脂質消化に影響を与える界面メカニズムおよび事象を特定するための実験的プラットフォームを提供する。
図2:胃腸脂質消化における界面の役割を示す模式図。ペプシン加水分解は胃相での界面組成を変化させ、胃リパーゼはトリグリセリドを加水分解します。小腸では、トリプシン/キモトリプシンが界面膜をさらに加水分解し、脂肪分解はBS/リパーゼの吸着、トリグリセリドの加水分解、およびBSミセル/複合体への可溶化による脂肪分解生成物の脱着によって進行します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
グラナダ大学(UGR)のペンダントドロップ装置は、バルク溶液7のサブフェーズ交換を可能にする特許技術である同軸ダブルキャピラリーで実装されています。ペンダントドロップを保持するキャピラリーは、ダブルマイクロインジェクターの各チャネルに独立して接続された2つの同軸キャピラリーの配置で構成されています。各マイクロインジェクタは独立して動作することができ、スルーフロー7による滴下内容物の交換を可能にする。したがって、サブフェーズ交換は、同じ流量を使用して、内側キャピラリーを備えた新しい溶液の同時注入と、外側キャピラリーとのバルク溶液の抽出で構成されます。このプロセスにより、界面領域または液滴の体積を乱すことなくバルク溶液の交換が可能になります。この手順は後にマルチサブフェーズ交換にアップグレードされ、液滴バルク溶液8の最大8つの連続サブフェーズ交換が可能になります。これにより、バルク溶液をさまざまなコンパートメント(口、胃、小腸)を模倣した人工培地と順次交換することにより、脂質媒体に懸濁した単一の水性液滴での消化プロセスのシミュレーションが可能になります。コンポーネントの詳細を含め、セットアップ全体を 図3に示します。マイクロインジェクター内のシリンジは8つのビアバルブに接続されており、それぞれが 図2に説明されているコンポーネントを含む人工消化液を含むマイクロ遠心チューブに接続されています。
図3:すべてのコンポーネントを含むOCTOPUSの全体図。CCDカメラ、顕微鏡、マイクロポジショナー、熱安定化セル、およびダブルキャピラリーは、8つのビアバルブに接続された2つのシリンジを備えたダブルマイクロインジェクターに独立して接続されています。各シリンジは、キャピラリー、サンプルと1つの排出を含む4つのマイクロ遠心チューブに接続します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4A は、各人工消化液が二重毛細管を介したサブフェーズ交換によってペンダントドロップに注入される方法を示しています。 図2 に詳述されている各消化化合物は、胃腸管を通過することをシミュレートして、同時/順次に適用できます。人工消化液には、図 4Bに図示されているように、初期乳化剤の界面張力を変化させるさまざまな酵素とバイオサーファクタントが含まれています。同じくUGRで開発されたソフトウェアDINATEN( 材料表を参照)は、最初の界面層が in vitroで消化されるときの界面張力の変化をリアルタイムで記録します。また、各消化相の後、安定化された界面層に体積/界面領域の周期的な振動を課し、界面張力の応答を記録することによって、界面層の拡張弾性が計算されます。振動の周期/周波数と振幅を変えることができ、ソフトウェアCONTACTOによる画像処理は拡張レオロジーパラメータを提供します8。
図4:消化プロファイルの例 。 (a)初期乳化剤層は、ペンダントドロップへの異なる溶液の順次サブフェーズ交換によってマイクロ遠心分離機に入れられた人工消化媒体に供される。(B)初期乳化剤の界面張力(y軸)の一般的な進化は、人工培地中のさまざまな酵素/バイオサーファクタントによって in vitro で消化されるときの時間(x軸)の関数です。普通の腸液との最終亜相交換は、混合ミセルの可溶化による消化脂質の脱着を測定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この研究は、ペンダントドロップ装置9を使用して界面層のin vitro消化を測定するために設計された一般的なプロトコルを提示します。最初の界面層は、図2に示すように、胃腸管を通過することを模倣する条件に順次さらされる。これらの異なる消化媒体は、マイクロ遠心チューブに含まれる異なる溶液のサブフェーズ交換によってペンダントドロップに注入されます(図4A)。これらの培地の組成は、評価される胃腸の状態、すなわち胃/腸のタンパク質分解/脂肪分解に応じてカスタマイズすることができ、累積効果と副活性を測定することができます10。各コンパートメントでの消化プロセスを模倣するために使用される実験条件は、電解質と酵素のpHと量を詳述したINFOGESTによって発行された国際的なコンセンサスプロトコルに従います11。ペンダントドロップに基づく実験装置は、シミュレートされた消化プロセス全体を通して、その場での界面張力の記録を可能にします。界面層の拡張レオロジーは、各消化ステップの最後に計算されます。このようにして、各乳化剤は、図4Bに描かれているように、消化された界面の特性を示す消化プロファイルを提供する。これにより、消化過程のさまざまな段階に対する感受性または耐性に関する結論を引き出すことができます。一般に、人工消化媒体には、酸/塩基性pH、電解質、プロテアーゼ(胃および腸)、リパーゼ(胃および腸)、胆汁酸塩、およびリン脂質が含まれており、これらはそれぞれの消化液(胃または腸)に溶解します。図4Bは、乳化剤の界面張力の進化の一般的なプロファイルを示しており、最初にプロテアーゼ作用を受け、次にリパーゼが続きます。一般に、界面層のタンパク質分解は、加水分解ペプチド9,12の脱離による界面張力の増加を促進し、一方、脂肪分解は、胆汁酸塩およびリパーゼ13の吸着による界面張力の非常に急な低下をもたらす。腸液との最終的な亜相交換は、未吸着/消化された物質のバルク溶液を枯渇させ、可溶性化合物の脱着および混合ミセル中の消化脂質の可溶化を促進する。これは、記録された界面張力の増加によって定量化されます(図4B)。
要約すると、単一の液滴におけるin vitro消化をシミュレートするためにペンダントドロップに実装された実験計画は、消化プロセスが最初の界面層10に順次適用されるときの累積効果および相乗効果を測定することを可能にする。各消化媒体の組成は、胃腸の病状または乳児の消化媒体を含む消化状態の特殊性を説明するために容易に調整することができる14。次に、タンパク質分解と脂肪分解に影響を与える界面メカニズムの同定を使用して、エマルジョンの界面工学による消化を調節することができます。得られた結果は、低アレルゲン性、制御されたエネルギー摂取量、消化率の低下などの調整された機能を備えた新しい食品マトリックスの設計に適用できます15,16,17,18,19。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、ペンダントドロップ装置を使用して界面層のin vitro消化を測定するための一般化されたプロトコルについて説明します。プロトコルは、文献との比較を容易にするためにINFOGEST11,20調和プロトコルに基づく消化バッファーの組成を調整することにより、実験の特定の要件に合わせて調整できます。消化酵素およびバイオサーフ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、プロジェクトRTI2018-101309-B-C21およびPID2020-631-116615RAI00によって資金提供され、MCIN/AEI/10.13039/501100011033および「ERDF A way of make Europe」によって資金提供されました。この研究は、グラナダ大学(スペイン)のバイオコロイドおよび流体物理学グループ(参照:PAI-FQM115)によって(部分的に)サポートされました。
Materials
| Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | C4129 | Enzyme |
| Beta-lactoglobulin | Sigma-Aldrich | L0130 | Emulsfier |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Emulsfier |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Electrolyte |
| Centrifuge | Kronton instruments | Centrikon T-124 | For separating oil and resins |
| Citrus pectin | Sigma-Aldrich | P9135 | Emulsfier |
| co-lipase FROM PORCINE PANCREAS | Sigma | C3028 | Enzyme |
| CONTACTO | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| DINATEN | University of Granada (UGR) | https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022 | |
| Gastric lipase | Lipolytech | RGE15-1G | Enzyme |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 70024-90-7 | Emulsifier |
| INFOGEST | http://www.proteomics.ch/IVD/ | ||
| Lipase from porcine pancreas, type II | Sigma-Aldrich | L33126 | Enzyme |
| Magnesium metasilicate resins | Fluka | 1343-88-0 | Resins to purify oil |
| Micro 90 | International products | M-9051-04 | Cleaner |
| NaCl | Sigma | 7647-14-5 | Electrolyte |
| NaH2PO4 | Scharlau | 10049-21-5 | To prepare buffer |
| OCTOPUS | Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) | Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange | |
| Olive oil | Sigma-Aldrich | 1514 | oil |
| Pancreatic from porcine pancreas | Sigma | P7545-25 g | Enzyme |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | Enzyme |
| Pluronic F127 | Sigma | P2443 | Emulsifier |
| Pluronic F68 | Sigma | P1300 | Emulsfier |
| Sodium deoxycholate | Sigma | Bile salts | |
| Sodium glycodeoxycholate | Sigma | C9910 | Bile salts |
| Sodium taurocholate | Sigma | 86339 | Bile salts |
| Syringe Filter | Millex-DP | SLGP033R | Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | Enzyme |
References
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