यहां हम एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण या अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक परख जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अल्पकालिक कशेरुक मॉडल नोथोब्रांचियस फर्ज़ेरी के दिमाग से नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
कशेरुक प्रणालियों में एकल-कोशिका संकल्प पर मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन लागत, समय और तकनीकी बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम स्वाभाविक रूप से अल्पकालिक कशेरुक अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफिश नोथोब्रांचियस फर्ज़ेरी के दिमाग से एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश का जीवनकाल 4-6 महीने है और इसे लागत प्रभावी तरीके से रखा जा सकता है, इस प्रकार कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए लागत और समय की बाधाओं को कम किया जा सकता है। हालांकि, युवा और वृद्ध मछलियों के मस्तिष्क से डाउनस्ट्रीम एकल-कोशिका प्रयोगों के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के नाभिक को अलग करने के लिए अनुरूप प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां, हम वयस्क अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफिश के मस्तिष्क से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक के अलगाव के लिए एक अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक ओमिक पुस्तकालयों की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि दूषित पृष्ठभूमि आरएनए को कम करने के कदम सेल प्रकारों को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सारांश में, यह प्रोटोकॉल गैर-पारंपरिक कशेरुक मॉडल जीवों में मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन करने की व्यवहार्यता को दर्शाता है।
कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के तंत्र को समझना अल्जाइमरऔर मनोभ्रंश जैसे उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश (नोथोब्रांचस फर्ज़ेरी) सबसे कम समय तक रहने वाला कशेरुक है जिसे कैद में पैदा किया जा सकता है, और इसके छोटे जीवनकाल और उम्र से जुड़े संज्ञानात्मक हानि के कारण, यह एक उत्कृष्ट मस्तिष्क उम्र बढ़ने वाला मॉडल 2,3,4,5 है। हाल ही में, एकल-कोशिका “ओमिक्स” प्रौद्योगिकियों के आगमन, जैसे एकल नाभिक आरएनए-सेक (एसएनआरएनए-सेक) और अनुक्रमण (एसएनएटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल नाभिक परख ने शोधकर्ताओं को एक अभूतपूर्व रिज़ॉल्यूशन 6,7,8 पर उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क से पूछताछ करने की अनुमति दी है। ये विधियां नाभिक अलगाव पर निर्भर करती हैं, क्योंकि न्यूरॉन्स जैसे मस्तिष्क कोशिकाओं की वसूली अक्सर 6,7,8,9,10 को अलग करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण होती है। हालांकि, अधिकांश प्रकाशित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल स्तनधारी मॉडलजीवों 11,12,13,14,15 के लिए अनुकूलित हैं। इस प्रकार, जैसा कि वर्तमान में उम्र बढ़ने के अनुसंधान2 के क्षेत्र में एक नए मॉडल जीव के रूप में किलीफिश में मस्तिष्क नाभिक को अलग करने की आवश्यकता है, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य जमे हुए मस्तिष्क किलीफिश ऊतक से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक विधि स्थापित करना है।
यहां, एक सुव्यवस्थित और मजबूत वर्कफ़्लो स्थापित किया गया है जो किलीफिश दिमाग से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए आमतौर पर उपलब्ध सामग्रियों का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल को माउस दिमाग के लिए 10x जीनोमिक्स प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था ताकि अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश के निचले माइलिन सामग्री दिमाग, जमे हुए ऊतक की नाजुकता और अनुक्रमण से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए परिवेश मलबे सामग्री को कम करने की आवश्यकता कोसमायोजित किया जा सके। दरअसल, स्तनधारी मस्तिष्क ऊतक17,18 के लिए पहले से अनुकूलित प्रोटोकॉल खराब नाभिक गुणवत्ता (यानी, ओवरलिसिस) और / या उच्च मलबे सामग्री का कारण बनते हैं जब जमे हुए किलीफिश दिमाग पर उपयोग किया जाता है, जिससे वे माइक्रोफ्लुइडिक्स (पूरक चित्रा 1) का उपयोग करके एकल नाभिक आरएनए-सेक के लिए सिफारिशों के अनुसार एसएनआरएनए-सेक के साथ उपयोग के लिए अनुपयुक्त हो जाते हैं।
नाभिक अलगाव के अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नाभिक की गुणवत्ता और उपज का आकलन कैसे किया जाए। यह आलेख इष्टतम और उप-मानक परिणाम दोनों के उदाहरण प्रदान करता है और समस्या निवारण पर चर्चा करता है। इस प्रोटोकॉल को जमे हुए किलीफिश दिमाग के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया था, लेकिन ताजा विच्छेदित किलीफिश नमूनों पर बड़े संशोधनों के बिना भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके पृथक किलीफिश मस्तिष्क नाभिक को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के रूप में एकल नाभिक आरएनए-सेक (एसएनआरएनए-सेक) में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन एसएनएटीएसी-सीक और थोक एटीएसी-सीक में उपयोग के लिए भी अनुकूल होना चाहिए।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग किलीफिश दिमाग से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से किलीफिश मस्तिष्क के लिए डिज़ाइन किया जाना था क्योंकि विशिष्ट स्तनधारी-आधारित मस्तिष्क नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल किलीफिश दिमाग पर लागू होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हमारे हाथों में खराब नाभिक की गुणवत्ता होती है। हमें संदेह है कि यह उनके स्तनधारी समकक्षों की तुलना में किलीफिश मस्तिष्क की कम सापेक्ष माइलिन सामग्री के कारण है, जो स्तनधारी मस्तिष्क कोशिका लाइसिस के लिए आवश्यक कठोर परिस्थितियों के जवाब में लाइस और क्लंप होगा। यह प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने और किलीफिश क्षेत्रों में एक प्रगति है क्योंकि यह कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के लागत और समय प्रभावी मॉडल में एकल-कोशिका स्तर पर मस्तिष्क की उम्र बढ़ने की खोज की सुविधा प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल ताजा या जमे हुए नमूनों के लिए मजबूत है, हालांकि ताजा या जमे हुए ऊतक का उपयोग करते समय डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर विचार करना चाहिए। जमे हुए ऊतक अक्सर सुविधाजनक होते हैं क्योंकि इसे महीनों तक एकत्र और संग्रहीत किया जा सकता है जबकि नमूने एकत्र किए जाते हैं। इस तरह के नमूने एसएनआरएनए-सेक जैसे अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षित रूप से उपयोग किए जा सकते हैं। हालांकि, ठंड के नमूने परमाणु संरचना को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार एटीएसी-सेक21 द्वारा क्रोमैटिन परिदृश्य को सटीक रूप से मापने की क्षमता। इस प्रकार, थोक एटीएसी-सेक या एसएनएटीएसी-सेक जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, जमे हुए दिमाग के बजाय ताजा विच्छेदित दिमाग का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, क्योंकि मस्तिष्क होमोजेनाइजेशन के बाद सभी चरण समानांतर में किए जा सकते हैं, यह प्रोटोकॉल एक उचित समय सीमा में कई नमूने चलाने के लिए उत्तरदायी है, इस प्रकार बर्फ पर लंबे समय तक इनक्यूबेशन के कारण आरएनए क्षरण को सीमित करता है।
इसके अलावा, नाभिक निष्कर्षण करने के बफर को ताजा (घंटों के भीतर) तैयार करना अनिवार्य है। हमने पाया कि प्रोटोकॉल शुरू करने से तुरंत पहले डिटर्जेंट के साथ-साथ बीएसए को बफर में जोड़ा जाना चाहिए। केवल लवण (पीबीएस, एनएसीएल, आदि) वाले बफर को एकाग्रता के रूप में बनाया जा सकता है, फ़िल्टर निष्फल (0.22 μm), और कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। बीएसए स्टॉक समाधान नाभिक निष्कर्षण के दिनों के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार, निष्फल और संग्रहीत किया जा सकता है (यदि पाउडर से तैयार किया गया है) लेकिन प्रोटोकॉल शुरू करने से तुरंत पहले इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर में हमेशा जोड़ा जाना चाहिए। हालांकि, हम प्रोटोकॉल के दिन बीएसए समाधान तैयार करने की सलाह देते हैं। यदि किसी तीसरे पक्ष से पूर्वनिर्मित बीएसए समाधान का उपयोग कर रहे हैं, तो ताजा, खुली बोतलों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। ताजा बीएसए का उपयोग करने से आम तौर पर नाभिक की तैयारी में मलबे की मात्रा कम हो जाती है।
चाहे ताजा या जमे हुए नमूने इनपुट के रूप में उपयोग किए जाते हैं, नाभिक अलगाव के बाद नाभिक की गुणवत्ता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। हालांकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से अतिलिसिस से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह नाभिक की गुणवत्ता के नुकसान का सबसे आम कारण है। ओवरलिसिस का परिणाम लाइसिस बफर में बहुत अधिक समय बिताने, नाभिक के अत्यधिक खुरदरे हैंडलिंग जैसे कि मानक बोर पिपेट टिप के साथ अत्यधिक पाइपिंग, या नाभिक अलगाव और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (>1 घंटे) के बीच अत्यधिक समय बिताने के कारण हो सकता है। अत्यधिक नाभिक में अक्सर परमाणु पेरिफेरीज क्षतिग्रस्त होते हैं, जो डीएनए को लीक करते हैं और झुरमुट का कारण बनते हैं (चित्रा 2 बी)। इससे मल्टीपल्स की संख्या में वृद्धि होगी और पृष्ठभूमि न्यूक्लिक एसिड का योगदान होगा जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों, विशेष रूप से एसएनआरएनए-सेक में हस्तक्षेप करेगा। नाभिक अलगाव के बाद माइक्रोस्कोपी द्वारा दोनों गुणों का मूल्यांकन किया जा सकता है। यदि अत्यधिक परमाणु झुरमुट देखा जाता है, तो हम ओवरलिसिस की संभावना को कम करने के लिए इनक्यूबेशन लाइसिस चरण को छोटा करने की कोशिश करने की सलाह देते हैं। नाभिक सिंगल्स को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, फ्लोरेसेंस-असिस्टेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग इस प्रोटोकॉल के डाउनस्ट्रीम सिंगल्स के लिए समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, हम ध्यान दें कि, जमे हुए ऊतक से पहले से ही नाजुक नाभिक के साथ काम करते समय, छंटाई के दौरान होने वाले कतरनी तनाव से परमाणु टूटना बढ़ सकता है और इस प्रकार परिवेश आरएनए / डीएनए में वृद्धि हो सकती है। इसके अलावा, हम ध्यान दें कि कई नमूनों को संसाधित करते समय नाभिक के लिए एफएसीएस उपज प्रकार चलाने के लिए आवश्यक समय के लिए सभी नाभिक के नमूनों को घंटों तक बर्फ पर रहने की आवश्यकता होगी, जबकि अन्य नमूनों को क्रमबद्ध किया जा रहा है। इस प्रकार, एफएसीएस दृष्टिकोण के समानांतर कई नमूनों को संसाधित करते समय प्रतीक्षा समय में वृद्धि से समग्र रूप से नाभिक की गुणवत्ता कम हो सकती है और आरएनए क्षरण का खतरा बढ़ सकता है। इस प्रकार, यदि एफएसीएस कम दोगुनी दर के लिए वांछित है, तो हम अनुशंसा करते हैं कि उपज प्रकार के बाद मलबे की सामग्री को फिर से जांचा जाना चाहिए और संभावित चेतावनी के रूप में एकल सेल आरएनए-सेक अनुप्रयोगों के लिए संभावित कम आरएनए गुणवत्ता को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
नाभिक की गणना और एकल अनुपात का एक सटीक अनुमान लगभग सभी डाउनस्ट्रीम “ओमिक्स” अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है और अत्यंत महत्वपूर्ण है। आकार द्वारा नाभिक को आसानी से गेट और गिनने की क्षमता के कारण, फ्लो साइटोमेट्री नाभिक की गणना करने का सबसे सटीक तरीका है जिसका हमने आकलन किया है। वैकल्पिक रूप से, कोई इनविट्रोजेन काउंटेस 2 एफएल ऑटोमेटेड सेल काउंटर या डीनोविक्स सेलड्रॉप ऑटोमेटेड सेल काउंटर जैसे सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की मात्रा निर्धारित कर सकता है। ध्यान देने के लिए, इनविट्रोजेन के काउंटेस 2 एफएल ऑटोमेटेड सेल काउंटर, और बहुत कम हद तक डीनोविक्स, मलबे को नाभिक के रूप में गिनकर नाभिक की गिनती को अधिक महत्व देते हैं, जिसका अर्थ है कि मैन्युअल आकार गेटिंग की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमीटर किसी को नाभिक की शुद्धता का आसानी से आकलन करने की अनुमति देता है। कोई मात्रात्मक तरीके से एकल बनाम एकाधिक नाभिक के सापेक्ष अनुपात को समझ सकता है जो माइक्रोस्कोपी द्वारा मुश्किल है। यह एसएनआरएनए-सेक और एसएनटीएसी-सेक के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे प्रोटोकॉल एकाधिक नमूनों के अधिशेष से पीड़ित होंगे, जिन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। मल्टीपल्स के अलावा, “मलबे” (खंडित नाभिक, सेलुलर मलबे) के सापेक्ष अनुपात को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और अपेक्षाकृत कम होना चाहिए, क्योंकि इस सामग्री में अक्सर दूषित न्यूक्लिक एसिड होते हैं जो पृष्ठभूमि संकेत और भ्रष्ट एकल नाभिक “ओमिक्स” डेटा का योगदान कर सकते हैं।
जैसा कि पहले वर्णित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल के साथ होता है, मूल ऊतक में सेल प्रकारों के अनुपात को नाभिक प्रीप19 में ईमानदारी से पुन: परिभाषित नहीं किया जा सकता है, और इस प्रकार सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। ध्यान देने के लिए, सभी टेलोस्ट की तरह, अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश में न्यूक्लियेटेड एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, जिन्हें नाभिक की तैयारी में भी प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है। इन नाभिकों को हीमोग्लोबिन जीन की उच्च अभिव्यक्ति / पहुंच द्वारा एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएएसी-सेक डेटासेट में पहचाना जा सकता है और वांछित होने पर कम्प्यूटेशनल रूप से बाहर रखा जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
कुछ पैनल BioRender.com के साथ उत्पन्न किए गए थे। हमारी प्रयोगशाला में इस काम को एनआईए टी 32 एजी 052374 पोस्टडॉक्टरल ट्रेनिंग ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था, एजिंग ब्रेन में प्लास्टिसिटी के लिए सिमंस सहयोग के हिस्से के रूप में सिमंस फाउंडेशन से अनुदान, नेविज फाउंडेशन से एक पायलट अनुदान, और बीएबी को हैनसन-थोरेल फैमिली अवार्ड।
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |