Här presenterar vi ett protokoll för att isolera kärnor från hjärnorna i den kortlivade ryggradsdjursmodellen Nothobranchius furzeri för nedströmsapplikationer såsom enkärnig RNA-sekvensering eller enkärnanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (ATAC-seq).
Att studera hjärnans åldrande vid encellsupplösning i ryggradsdjursystem är fortfarande utmanande på grund av kostnad, tid och tekniska begränsningar. Här demonstrerar vi ett protokoll för att generera enkärniga RNA-sekvenseringsbibliotek (snRNA-seq) från hjärnorna hos den naturligt kortlivade ryggradsdjuren African turquoise killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanska turkosa killifisken har en livslängd på 4-6 månader och kan inrymmas på ett kostnadseffektivt sätt, vilket minskar kostnads- och tidsbarriärerna för att studera ryggradsdjurens hjärnåldring. Det behövs dock skräddarsydda protokoll för att isolera kärnor av tillräcklig kvalitet för nedströms encellsexperiment från hjärnan hos unga och åldrade fiskar. Här demonstrerar vi ett empiriskt optimerat protokoll för isolering av högkvalitativa kärnor från hjärnan hos vuxna afrikanska turkos killifish, ett kritiskt steg i genereringen av högkvalitativa enkärniga omiska bibliotek. Dessutom visar vi att stegen för att minska förorenande bakgrunds-RNA är viktiga för att tydligt skilja celltyper. Sammanfattningsvis visar detta protokoll möjligheten att studera hjärnans åldrande i icke-traditionella ryggradsdjurs modellorganismer.
Att förstå mekanismerna för ryggradsdjurs hjärnåldring är avgörande för att ta itu med åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och demens1. Den afrikanska turkosa killifisken (Nothobranchus furzeri) är det kortaste levande ryggradsdjuret som kan födas upp i fångenskap, och på grund av dess korta livslängd och åldersassocierade kognitiva försämring är det en utmärkt hjärnåldringsmodell 2,3,4,5. Nyligen har tillkomsten av encells “omics” -teknik, såsom enkärniga RNA-seq (snRNA-seq) och enkärnanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (snATAC-seq), gjort det möjligt för forskare att förhöra den åldrande hjärnan med en aldrig tidigare skådad upplösning 6,7,8. Dessa metoder är beroende av kärnisolering, eftersom återhämtningen av hjärnceller som neuroner ofta är för utmanande för att isolera 6,7,8,9,10. De flesta publicerade kärnisoleringsprotokoll är dock optimerade för däggdjursmodellorganismer 11,12,13,14,15. Eftersom det för närvarande finns ett ouppfyllt behov av att isolera hjärnkärnor i killifish som en kommande ny modellorganism inom åldrandeforskning2, är målet med detta protokoll att etablera en metod för att isolera högkvalitativa kärnor från frusen hjärnkillifishvävnad.
Här etableras ett strömlinjeformat och robust arbetsflöde som använder allmänt tillgängliga material för att isolera högkvalitativa kärnor från killifish-hjärnor. Detta protokoll modifierades från ett 10x Genomics-protokoll för mushjärnor för att rymma hjärnan med lägre myelininnehåll hos afrikansk turkos killifish, bräckligheten hos frusen vävnad och behovet av att minska omgivande skräpinnehåll för sekvenseringsrelaterade applikationer16. Faktum är att tidigare optimerade protokoll för däggdjurs hjärnvävnad17,18 leder till dålig kärnkvalitet (dvs. överlys) och/eller högt skräpinnehåll när de används på frysta killifish-hjärnor, vilket gör dem olämpliga för användning med snRNA-seq enligt rekommendationer för RNA-seq med en kärna RNA-seq med hjälp av mikrofluidik (kompletterande figur 1).
Förutom kärnisolering visar vi hur man bedömer kärnornas kvalitet och utbyte genom mikroskopi och flödescytometri. Den här artikeln innehåller exempel på både optimala och suboptimala resultat och diskuterar felsökning. Detta protokoll designades och optimerades för frysta killifish-hjärnor men kan också användas utan större modifieringar på nyligen dissekerade killifish-prover. Killifish hjärnkärnor isolerade med denna metod har optimerats för användning i enkärnig RNA-seq (snRNA-seq) som en nedströms applikation, men bör också vara mottagliga för användning i snATAC-seq och bulk ATAC-seq.
Protokollet som presenteras här kan användas för att reproducerbart generera högkvalitativa kärnor från killifish-hjärnor. Detta protokoll måste utformas speciellt för killifish-hjärnan eftersom typiska däggdjursbaserade hjärnkärnor isoleringsprotokoll som tillämpas på killifish-hjärnor konsekvent resulterade i dålig kärnkvalitet i våra händer. Vi misstänker att detta beror på det lägre relativa myelininnehållet i killifish-hjärnan jämfört med deras däggdjurs motsvarigheter, vilket skulle lysera och klumpa sig som svar på de hårda förhållanden som krävs för däggdjurs hjärncellslys. Detta protokoll är ett framsteg inom åldrande- och killifish-fälten eftersom det underlättar utforskningen av hjärnans åldrande på encellsnivå i en kostnads- och tidseffektiv modell av ryggradsdjurs hjärnåldring.
Detta protokoll är robust för färska eller frysta prover, även om man måste överväga nedströmsapplikationerna när man använder färsk eller frusen vävnad. Fryst vävnad är ofta bekvämt eftersom den kan samlas in och lagras i månader medan prover samlas in. Sådana prover kan säkert användas för applikationer som snRNA-seq. Frysningsprover kan dock störa kärnstrukturen och därmed förmågan att noggrant mäta kromatinlandskapet med ATAC-seq21. För nedströmsapplikationer som bulk ATAC-seq eller snATAC-seq rekommenderas det därför att använda nyligen dissekerade hjärnor istället för frysta hjärnor. Dessutom, eftersom alla steg efter hjärnhomogenisering kan utföras parallellt, är detta protokoll mottagligt för att köra flera prover inom en rimlig tidsram, vilket begränsar RNA-nedbrytning orsakad av långvarig inkubation på is.
Dessutom är det absolut nödvändigt att förbereda buffertar färska (inom några timmar) efter att ha utfört kärnextraktion. Vi fann att tvättmedel såväl som BSA måste tillsättas i buffertar omedelbart innan protokollet påbörjas. Buffertar som endast innehåller salter (PBS, NaCl, etc.) kan tillverkas som koncentrat, filtreras steriliseras (0,22 μm) och förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur. BSA-stamlösningar kan beredas, steriliseras och förvaras vid 4 °C inom några dagar efter extraktionen av kärnorna (om de framställs av pulver) men bör alltid tillsättas de buffertar som används i detta protokoll omedelbart innan protokollet genomförs. Vi rekommenderar dock att du förbereder BSA-lösningar på protokollets dag. Om du använder färdiga BSA-lösningar från en tredje part rekommenderas det att använda färska, oöppnade flaskor. Att använda färsk BSA leder i allmänhet till lägre skräpinnehåll i kärnförberedelser.
Oavsett om färska eller frysta prover används som insatsvaror är det viktigt att bedöma kärnkvaliteten efter kärnisolering. Även om detta protokoll är speciellt utformat för att undvika överlys, är detta den vanligaste orsaken till förlust av kärnkvalitet. Överlys kan bero på för mycket tid i lysbufferten, alltför grov hantering av kärnorna, såsom överdriven pipettering med en standardborrningspipettspets eller en överdriven tid mellan kärnisolering och nedströmsapplikationer (>1 h). Överlyserade kärnor har ofta skadade kärnperiferier, som läcker DNA och orsakar klumpar (figur 2B). Detta kommer att leda till ett ökat antal multiplets och bidra med bakgrundsnukleinsyror som kommer att störa nedströmsapplikationer, särskilt snRNA-seq. Båda egenskaperna kan bedömas genom mikroskopi efter kärnisolering. Om överdriven kärnklumpning observeras rekommenderar vi att du försöker förkorta lysstegsinkubationen för att minska risken för överlys. Som en alternativ metod för att öka kärnor singlets kan fluorescensassisterad cellsortering (FACS) användas för att berika för singlets nedströms detta protokoll. Vi noterar dock att när man arbetar med redan bräckliga kärnor från frusen vävnad kan skjuvspänningen som uppstår under sortering leda till ökad kärnbrott och därmed ökat omgivande RNA / DNA. Dessutom noterar vi att den tid som krävs för att köra en FACS-avkastningssortering för kärnor vid bearbetning av flera prover skulle kräva att alla kärnprover förblir på is i timmar, medan andra prover sorteras. Således kan ökade väntetider vid bearbetning av flera prover parallellt med FACS-metoden sannolikt också leda till övergripande minskad kärnkvalitet och öka risken för RNA-nedbrytning. Således, om FACS önskas för reducerad dubletthastighet, rekommenderar vi att skräpinnehållet kontrolleras igen efter avkastningssorteringen och att eventuell reducerad RNA-kvalitet beaktas för encells RNA-seq-applikationer som en potentiell varning.
En exakt uppskattning av kärnantal och singlet-andel är avgörande för nästan alla nedströms “omics” -applikationer och är av yttersta vikt. På grund av förmågan att enkelt grinda och räkna kärnor efter storlek är flödescytometri den mest exakta metoden för att räkna kärnor som vi har bedömt. Alternativt kan man kvantifiera kärnor med hjälp av cellräknare som Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. Observera att Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter, och i mycket mindre utsträckning DeNovix, tenderar att överskatta kärnor genom att räkna skräp som kärnor, vilket innebär att manuell storlek gating kan krävas. Dessutom gör flödescytometern att man enkelt kan bedöma kärnornas renhet. Man kan urskilja den relativa andelen singlet kontra multiplet kärnor på ett kvantitativt sätt som är svårt med mikroskopi. Detta är avgörande för snRNA-seq och snATAC-seq, eftersom dessa protokoll kommer att drabbas av ett överskott av flera prover, som måste uteslutas från analyser nedströms. Förutom multipleter kan den relativa andelen “skräp” (fragmenterade kärnor, cellulära skräp) kvantifieras med flödescytometri och måste vara relativt låg, eftersom detta material ofta innehåller förorenande nukleinsyror som kan bidra med en bakgrundssignal och korrupta “omics” -data med en kärna.
Som med tidigare beskrivna kärnisoleringsprotokoll kan proportionerna av celltyper i den ursprungliga vävnaden inte rekapituleras troget i kärnorna prep19 och bör därför tolkas med försiktighet. Att notera, som alla teleostar, har afrikanska turkosa killifish kärnade erytrocyter, som också förväntas representeras i kärnförberedelserna. Dessa kärnor kan identifieras i snRNA-seq- och snATAC-seq-dataset genom det högre uttrycket / tillgängligheten av hemoglobingener och kan uteslutas beräkningsmässigt om så önskas.
The authors have nothing to disclose.
Vissa paneler genererades med BioRender.com. Detta arbete i vårt laboratorium stöddes av NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant till B.T., ett bidrag från Simons Foundation som en del av Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, ett pilotbidrag från Navigage Foundation och ett Hanson-Thorell Family-pris till B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |