Isolement et reprogrammation neuronale directe des astrocytes de souris
Summary
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour générer des cultures hautement enrichies d’astrocytes dérivés de différentes régions du système nerveux central de souris postnatales et leur conversion directe en neurones fonctionnels par l’expression forcée de facteurs de transcription.
Abstract
La reprogrammation neuronale directe est une approche puissante pour générer des neurones fonctionnels à partir de différentes populations de cellules de départ sans passer par des intermédiaires multipotents. Cette technique est non seulement très prometteuse dans le domaine de la modélisation des maladies, car elle permet de convertir, par exemple, les fibroblastes pour les patients souffrant de maladies neurodégénératives en neurones, mais représente également une alternative prometteuse pour les thérapies de remplacement cellulaires. Dans ce contexte, une percée scientifique majeure a été la démonstration que des cellules non neurales différenciées dans le système nerveux central, telles que les astrocytes, pouvaient être converties en neurones fonctionnels in vitro. Depuis lors, la reprogrammation directe in vitro des astrocytes en neurones a fourni des informations substantielles sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la conversion forcée de l’identité et les obstacles qui empêchent une reprogrammation efficace. Cependant, les résultats d’expériences in vitro réalisées dans différents laboratoires sont difficiles à comparer en raison des différences dans les méthodes utilisées pour isoler, cultiver et reprogrammer les astrocytes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour isoler et cultiver de manière fiable des astrocytes de haute pureté provenant de différentes régions du système nerveux central de souris à des âges postnatals via le tri de cellules magnétiques. De plus, nous fournissons des protocoles pour reprogrammer les astrocytes cultivés en neurones par transduction virale ou transfection de l’ADN. Ce protocole rationalisé et standardisé peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents au maintien de l’identité cellulaire, à l’établissement d’une nouvelle identité neuronale, ainsi qu’à la génération de sous-types neuronaux spécifiques et à leurs propriétés fonctionnelles.
Introduction
Le système nerveux central (SNC) des mammifères est très complexe, composé de centaines de types cellulaires différents, y compris un grand nombre de sous-types neuronaux différents 1,2,3,4,5,6. Contrairement à d’autres organes ou tissus 7,8,9, le SNC des mammifères a une capacité de régénération très limitée; La perte neuronale à la suite d’un traumatisme crânien ou d’une neurodégénérescence est irréversible et entraîne souvent des déficits moteurs et cognitifs10. Visant à sauver les fonctions cérébrales, différentes stratégies pour remplacer les neurones perdus font l’objet d’une enquête intense11. Parmi eux, la reprogrammation directe des cellules somatiques en neurones fonctionnels émerge comme une approche thérapeutique prometteuse12. La reprogrammation directe, ou transdifférenciation, est le processus de conversion d’un type de cellule différencié en une nouvelle identité sans passer par un état prolifératif ou pluripotent intermédiaire 13,14,15,16. Pionnière par l’identification de MyoD1 comme facteur suffisant pour convertir les fibroblastes en cellules musculaires17,18, cette méthode a été appliquée avec succès pour reprogrammer plusieurs types de cellules en neurones fonctionnels 19,20,21.
Les astrocytes, la macroglie la plus abondante du SNC22,23, sont un type cellulaire particulièrement prometteur pour la reprogrammation neuronale directe pour plusieurs raisons. Tout d’abord, ils sont largement et uniformément répartis dans le SNC, fournissant une source abondante en loco pour de nouveaux neurones. Deuxièmement, les astrocytes et les neurones sont étroitement liés sur le plan du développement, car ils partagent un ancêtre commun au cours du développement embryonnaire, les cellules gliales radiales24. L’origine embryonnaire commune des deux types de cellules semble faciliter la conversion neuronale par rapport à la reprogrammation des cellules de différentes couches germinales 19,21. En outre, les informations de modelage héritées par les astrocytes à travers leur origine gliale radiale sont également maintenues dans les astrocytes adultes 25,26,27, et semblent contribuer à la génération de sous-types neuronaux 28,29,30 appropriés à la région. Par conséquent, l’étude et la compréhension de la conversion des astrocytes en neurones sont un élément important pour atteindre le plein potentiel de cette technique pour les stratégies de remplacement cellulaires.
La conversion d’astrocytes cultivés in vitro en neurones a conduit à plusieurs percées dans le domaine de la reprogrammation neuronale directe, notamment : i) l’identification de facteurs de transcription suffisants pour générer des neurones à partir d’astrocytes 15,19,31, ii) le démêlage des mécanismes moléculaires déclenchés par différents facteurs de reprogrammation dans le même contexte cellulaire 32 , et iii) mettre en évidence l’impact de l’origine développementale des astrocytes sur l’induction de différents sous-types neuronaux 28,29,33. En outre, la conversion directe in vitro des astrocytes a permis de surmonter plusieurs obstacles majeurs qui limitent la reprogrammation neuronale directe34,35, tels que l’augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS)34 et les différences entre le protéome mitochondrial des astrocytes et des neurones35. Par conséquent, ces observations soutiennent fortement l’utilisation de cultures primaires d’astrocytes comme modèle de reprogrammation neuronale directe pour étudier plusieurs questions fondamentales en biologie12, liées au maintien de l’identité cellulaire, aux obstacles empêchant les changements de destin cellulaire, ainsi qu’au rôle du métabolisme dans la reprogrammation.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour isoler les astrocytes de souris à l’âge postnatal (P) avec une très grande pureté, comme démontré en isolant les astrocytes de la moelle épinière murine29. Nous fournissons également des protocoles pour reprogrammer les astrocytes en neurones par transduction virale ou transfection de plasmides d’ADN. Les cellules reprogrammées peuvent être analysées 7 jours après la transduction (7 DPT) pour évaluer divers aspects, tels que l’efficacité de la reprogrammation et la morphologie neuronale, ou peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs semaines, pour évaluer leur maturation au fil du temps. Il est important de noter que ce protocole n’est pas spécifique aux astrocytes de la moelle épinière et peut être facilement appliqué pour isoler les astrocytes de diverses autres régions du cerveau, y compris la matière grise corticale, le mésencéphale et le cervelet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cultures primaires d’astrocytes murins sont un système modèle in vitro remarquable pour étudier la reprogrammation neuronale directe. En fait, bien qu’isolées à un stade postnatal, les cellules expriment des marqueurs astrocytaires typiques29, conservent l’expression des gènes de motif 28,29 et maintiennent la capacité de proliférer, semblable aux astrocytes in vivo à un âge comparablede 38 ans.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Ines Mühlhahn pour le clonage des constructions pour la reprogrammation, Paulina Chlebik pour la production virale, et Magdalena Götz et Judith Fischer-Sternjak pour les commentaires sur le manuscrit.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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