Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux

Summary

Un protocole de quantification fluorescente par cytométrie en flux des cellules cancéreuses sénescentes induites par des médicaments de chimiothérapie en culture cellulaire ou dans des modèles tumoraux murins est présenté. Les procédures facultatives comprennent le co-immunomarquage, la fixation d’échantillons pour faciliter l’analyse de grands lots ou de points temporels, et l’enrichissement de cellules sénescentes viables par tri cytométrique en flux.

Abstract

La sénescence cellulaire est un état d’arrêt prolifératif induit par des dommages biologiques qui s’accumulent normalement au fil des ans dans les cellules vieillissantes, mais qui peut également émerger rapidement dans les cellules tumorales en réponse aux dommages induits par divers traitements contre le cancer. La sénescence des cellules tumorales est généralement considérée comme indésirable, car les cellules sénescentes deviennent résistantes à la mort et bloquent la rémission tumorale tout en exacerbant la tumeur maligne et la résistance au traitement. Par conséquent, l’identification des cellules tumorales sénescentes est d’un intérêt continu pour la communauté de recherche sur le cancer. Il existe divers tests de sénescence, dont beaucoup sont basés sur l’activité du marqueur de sénescence bien connu, la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-Gal).

Typiquement, le test SA-β-Gal est réalisé à l’aide d’un substrat chromogène (X-Gal) sur des cellules fixes, avec le dénombrement lent et subjectif des cellules sénescentes « bleues » par microscopie optique. Des tests améliorés utilisant des substrats fluorescents SA-β-Gal perméables aux cellules, y compris C_12-FDG (vert) et DDAO-Galactoside (DDAOG; rouge lointain), ont permis l’analyse de cellules vivantes et l’utilisation de plates-formes d’analyse fluorescentes à haut débit, y compris des cytomètres en flux. C_12-FDG est une sonde bien documentée pour SA-β-Gal, mais son émission fluorescente verte chevauche l’autofluorescence cellulaire intrinsèque (AF) qui survient pendant la sénescence en raison de l’accumulation d’agrégats de lipofuscine. En utilisant la sonde rouge lointain SA-β-Gal DDAOG, l’autofluorescence cellulaire verte peut être utilisée comme paramètre secondaire pour confirmer la sénescence, ajoutant ainsi de la fiabilité au test. Les canaux de fluorescence restants peuvent être utilisés pour la coloration de la viabilité cellulaire ou l’immunomarquage fluorescent facultatif.

En utilisant la cytométrie en flux, nous démontrons l’utilisation de DDAOG et de l’autofluorescence de la lipofuscine comme test à double paramètre pour l’identification des cellules tumorales sénescentes. La quantification du pourcentage de cellules sénescentes viables est effectuée. Si vous le souhaitez, une étape facultative d’immunomarquage peut être incluse pour évaluer les antigènes de surface cellulaire d’intérêt. Les cellules sénescentes identifiées peuvent également être triées cytométriquement en flux et collectées pour analyse en aval. Les cellules sénescentes collectées peuvent être immédiatement lysées (par exemple, pour des tests immunologiques ou des analyses omiques) ou cultivées.

Introduction

Les cellules sénescentes s’accumulent normalement dans les organismes au fil des ans au cours du vieillissement biologique normal, mais peuvent également se développer rapidement dans les cellules tumorales en réponse aux dommages induits par divers traitements contre le cancer, y compris la radiothérapie et la chimiothérapie. Bien qu’elles ne prolifèrent plus, les cellules tumorales sénescentes induites par le traitement (TIS) peuvent contribuer à la résistance au traitement et entraîner une récidive ^1,2,3. Les facteurs sécrétés par les cellules TIS peuvent exacerber la tumeur maligne en favorisant l’évasion immunitaire ou les métastases ^4,5. Les cellules TIS développent des phénotypes complexes et spécifiques au contexte, des profils métaboliques modifiés et des réponses immunitaires uniques ^6,7,8. Par conséquent, l’identification et la caractérisation des cellules tumorales TIS induites par diverses approches de traitement du cancer est un sujet d’intérêt continu pour la communauté de recherche sur le cancer.

Pour détecter les cellules tumorales TIS, les tests de sénescence conventionnels sont largement utilisés, principalement basés sur la détection d’une activité accrue de l’enzyme marqueur de sénescence, la bêta-galactosidase lysosomale GLB1⁹. La détection à un pH lysosomal presque neutre (plutôt qu’acide) permet une détection spécifique de la bêta-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-Gal)¹⁰. Un test SA-β-Gal standard utilisé depuis plusieurs décennies utilise X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un substrat chromogène bleu de la bêta-galactosidase, pour détecter la SA-β-Gal dans les cellules fixes par microscopie^{optique 11}. Le test X-Gal permet la confirmation visuelle qualitative du TIS à l’aide de réactifs et d’équipements de laboratoire couramment disponibles. Un microscope optique transmis de base est le seul instrument nécessaire pour évaluer la présence du chromogène bleu. Cependant, la procédure de coloration X-Gal peut manquer de sensibilité, nécessitant parfois plus de 24 heures pour que la couleur se développe. La coloration est suivie d’un score subjectif à faible débit des cellules sénescentes individuelles basé sur le comptage des cellules présentant un certain niveau d’intensité du chromogène bleu au microscope optique. Comme X-Gal est imperméable aux cellules, ce test nécessite des cellules fixées au solvant, qui ne peuvent pas être récupérées pour une analyse en aval. Lorsque vous travaillez avec des échantillons limités d’animaux ou de patients, cela peut être un inconvénient majeur.

Des dosages SA-β-Gal améliorés utilisant des substrats enzymatiques fluorescents perméants aux cellules, y compris le C 12-FDG (5-dodécanoylaminofluorescéine Di-β-D-Galactopyranoside, vert) et le DDAOG (9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one-7-yl) β-D-galactopyranoside, rouge lointain) ont déjà paru dans la littérature^12,13,14,15. La structure chimique de la sonde et les caractéristiques optiques du DDAOG sont illustrées à la figure supplémentaire S1. Ces sondes perméables permettent l’analyse de cellules vivantes (plutôt que fixes), et les sondes fluorescentes plutôt que chromogènes facilitent l’utilisation de plates-formes d’analyse fluorescentes rapides à haut débit, y compris des instruments de dépistage à haute teneur et des cytomètres en flux. Les cytomètres de flux de tri permettent la récupération de populations enrichies de cellules sénescentes vivantes à partir de cultures cellulaires ou de tumeurs pour une analyse en aval (par exemple, Western blotting, ELISA ou « omiques »). L’analyse de fluorescence fournit également un signal quantitatif, permettant une détermination plus précise du pourcentage de cellules sénescentes dans un échantillon donné. Des sondes fluorescentes supplémentaires, y compris des sondes de viabilité et des anticorps marqués au fluorophore, peuvent facilement être ajoutées pour l’analyse multiplexée de cibles au-delà de SA-β-Gal.

Semblable au DDAOG, le C_12-FDG est une sonde fluorescente pour SA-β-Gal, mais son émission fluorescente verte chevauche la FA cellulaire intrinsèque, qui survient lors de la sénescence en raison de l’accumulation d’agrégats de lipofuscine dans les cellules¹⁶. En utilisant la sonde DDAOG rouge lointain, la FA cellulaire verte peut être utilisée comme paramètre secondaire pour confirmer la sénescence¹⁷. Cela améliore la fiabilité du test en utilisant un deuxième marqueur en plus du SA-β-Gal, qui peut souvent être peu fiable en tant que marqueur unique de la sénescence¹⁸. Comme la détection de la FA endogène dans les cellules sénescentes est une approche sans marquage, il s’agit d’un moyen rapide et simple d’étendre la spécificité de notre test basé sur DDAOG.

Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de DDAOG et de la FA comme test rapide de cytométrie en flux à double paramètre pour l’identification de cellules tumorales TIS viables à partir de cultures in vitro ou isolées de tumeurs traitées par des médicaments établies chez la souris (Figure 1). Le protocole utilise des fluorophores compatibles avec une large gamme d’analyseurs et de trieurs de cytométrie en flux commerciaux standard (tableau 1). La quantification du pourcentage de cellules sénescentes viables à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux standard est activée. Si vous le souhaitez, une étape facultative d’immunomarquage peut être effectuée pour évaluer les antigènes de surface cellulaire d’intérêt en même temps que la sénescence. Les cellules sénescentes identifiées peuvent également être enrichies à l’aide de la méthodologie standard de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Figure 1 : Flux de travail expérimental. Un schéma résumant les points clés du test DDAOG. (A) Un médicament inducteur de TIS est ajouté à des cellules cultivées de mammifères ou administré à des souris porteuses de tumeurs. Un délai est alors prévu pour l’apparition du TIS: pour les cellules, 4 jours après le traitement; pour les souris, 22 jours au total, avec trois traitements tous les 5 jours plus 7 jours de récupération. Les cellules sont récoltées ou les tumeurs sont dissociées en suspension. (B) Les échantillons sont traités avec Baf pour ajuster le pH lysosomal pour la détection de SA-β-Gal pendant 30 min; ensuite, la sonde DDAOG est ajoutée pendant 60 minutes pour détecter SA-β-Gal. Les échantillons sont lavés 2x dans du PBS, et une tache de viabilité est brièvement ajoutée (15 min). En option, les échantillons peuvent être colorés avec des anticorps fluorescents dans des canaux de fluorescence ouverts et / ou fixés pour une analyse ultérieure. (C) Les échantillons sont analysés à l’aide d’un cytomètre en flux standard. Les cellules viables sont visualisées dans des diagrammes de points montrant le DDAOG rouge (indiquant SA-β-Gal) par rapport à l’autofluorescence verte (lipofuscine). Une porte pour déterminer le pourcentage de cellules TIS est établie en fonction des échantillons témoins non traités (non représentés). Si un cytomètre de tri (FACS) est utilisé, les cellules TIS peuvent être collectées et remises en culture pour d’autres tests in vitro ou lysées et traitées pour des essais de biologie moléculaire. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = sénescence induite par la thérapie; FL-Ab = anticorps conjugué au fluorophore; Baf = Bafilomycine A1; SA-β-Gal = bêta-galactosidase associée à la sénescence; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fluorophore	Détecte	Ex/Em (nm)	Cytomètre laser (nm)	Détecteur cytomètre / filtre passe-bande (nm)
Le	SA-β-Gal	645/6601	640	670 / 30
AF	Lipofuscine	< 600	488	525 / 50
CV450	Viabilité	408/450	405	450 / 50
PE	Anticorps/marqueur de surface	565/578	561	582 / 15

Tableau 1 : Fluorophores et spécifications optiques du cytomètre. Les spécifications du cytomètre utilisées dans ce protocole sont répertoriées pour un instrument avec un total de 4 lasers et 15 détecteurs d’émission. DDAOG détecté à 645/660 nm est la forme de la sonde clivée par SA-β-Gal¹. Le DDAOG onculé peut présenter une fluorescence de faible niveau à 460/610 nm, mais il est éliminé par les étapes de lavage prévues dans le protocole. Abréviations : DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescence; PE = phycoérythrine; SA-β-Gal = bêta-galactosidase associée à la sénescence.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux décrits ont été approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Chicago. 1. Préparation et stockage des solutions mères REMARQUE: Si les cellules doivent être triées en flux, toutes les solutions doivent être préparées à l’aide de techniques stériles et filtrées à travers un dispositif filtrant de 0,22 μm. Préparer une solution mère de…

Representative Results

Plusieurs expériences ont été réalisées pour démontrer la comparabilité du DDAOG au X-Gal et au C12-FDG pour la détection de la sénescence par SA-β-Gal. Tout d’abord, X-Gal a été utilisé pour colorer les cellules sénescentes du mélanome B16-F10 induites par ETO (Figure 2A). Une couleur bleue intense s’est développée dans un sous-ensemble de cellules traitées par ETO, tandis que d’autres cellules présentaient une coloration bleue moins intense. La morpholog…

Discussion

Au cours de la dernière décennie, la cytométrie en flux est devenue une plate-forme de dosage plus courante dans la recherche sur le cancer en raison de la popularité émergente de l’immunologie tumorale, du développement de cytomètres en flux à moindre coût et de l’amélioration des installations d’instrumentation partagées dans les établissements universitaires. Les tests multicolores sont maintenant standard, car la plupart des nouveaux instruments sont équipés de réseaux optiques violet, bleu-vert …

Materials

Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114