फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन के लिए फार-रेड फ्लोरोसेंट सेनेसेंस-संबद्ध β-गैलेक्टोसिडेस जांच
Summary
सेल कल्चर या मुराइन ट्यूमर मॉडल में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा प्रेरित सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट, फ्लो साइटोमेट्रिक परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वैकल्पिक प्रक्रियाओं में सह-इम्यूनोस्टेनिंग, बड़े बैच या समय बिंदु विश्लेषण की सुविधा के लिए नमूना निर्धारण, और प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग द्वारा व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं का संवर्धन शामिल है।
Abstract
सेलुलर सेनेसेंस जैविक क्षति से प्रेरित प्रोलिफेरेटिव गिरफ्तारी की स्थिति है जो आम तौर पर उम्र बढ़ने वाली कोशिकाओं में वर्षों से होती है, लेकिन विभिन्न कैंसर उपचारों से प्रेरित क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं में भी तेजी से उभर सकती है। ट्यूमर सेल सेनेसेंस को आमतौर पर अवांछनीय माना जाता है, क्योंकि सेनेसेंट कोशिकाएं मृत्यु के लिए प्रतिरोधी हो जाती हैं और ट्यूमर दुर्दमता और उपचार प्रतिरोध को बढ़ाते हुए ट्यूमर छूट को अवरुद्ध करती हैं। इसलिए, सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान कैंसर अनुसंधान समुदाय के लिए चल रही रुचि है। विभिन्न सेनेसेंस परख मौजूद हैं, जिनमें से कई प्रसिद्ध सेनेसेंस मार्कर, सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेज (एसए-β-गैल) की गतिविधि पर आधारित हैं।
आमतौर पर, एसए-β-गैल परख को निश्चित कोशिकाओं पर क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट (एक्स-गैल) का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा “नीली” सेनेसेंट कोशिकाओं की धीमी और व्यक्तिपरक गणना होती है। सेल-परमेंट, फ्लोरोसेंट एसए-β-गैल सब्सट्रेट्स का उपयोग करके बेहतर परख, जिसमें सी12-एफडीजी (ग्रीन) और डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड (डीडीएओजी; दूर-लाल) शामिल हैं, ने जीवित कोशिकाओं के विश्लेषण को सक्षम किया है और फ्लो साइटोमीटर सहित उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट विश्लेषण प्लेटफार्मों के उपयोग की अनुमति दी है। सी12-एफडीजी एसए-β-गैल के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित जांच है, लेकिन इसका हरा फ्लोरोसेंट उत्सर्जन आंतरिक सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस (एएफ) के साथ ओवरलैप होता है जो लिपोफसिन समुच्चय के संचय के कारण सेनेसेंस के दौरान उत्पन्न होता है। दूर-लाल एसए-β-गैल जांच डीडीएओजी का उपयोग करके, हरे सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग सेनेसेंस की पुष्टि करने के लिए द्वितीयक पैरामीटर के रूप में किया जा सकता है, जिससे परख में विश्वसनीयता जुड़ जाती है। शेष प्रतिदीप्ति चैनलों का उपयोग सेल व्यवहार्यता धुंधला या वैकल्पिक फ्लोरोसेंट इम्यूनोलेबलिंग के लिए किया जा सकता है।
फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते हुए, हम सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान के लिए दोहरे पैरामीटर परख के रूप में डीडीएओजी और लिपोफसिन ऑटोफ्लोरेसेंस के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित की जाती है। यदि वांछित हो, तो रुचि के सेल सतह एंटीजन का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक इम्यूनोलेबलिंग चरण शामिल किया जा सकता है। पहचाने गए सेनेसेंट कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्रिक रूप से क्रमबद्ध किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। एकत्रित सेनेसेंट कोशिकाओं को तुरंत लाइसिस किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, इम्यूनोएसे या ‘ओमिक्स विश्लेषण के लिए) या आगे सुसंस्कृत किया जा सकता है।
Introduction
सामान्य जैविक उम्र बढ़ने के दौरान सेनेसेंट कोशिकाएं आमतौर पर जीवों में जमा होती हैं, लेकिन विकिरण और कीमोथेरेपी सहित विभिन्न कैंसर उपचारों से प्रेरित क्षति की प्रतिक्रिया के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं में तेजी से विकसित हो सकती हैं। हालांकि अब प्रसार नहीं हो रहा है, चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंट (टीआईएस) ट्यूमर कोशिकाएं उपचार प्रतिरोध में योगदान कर सकती हैं और पुनरावृत्ति 1,2,3 चला सकती हैं। टीआईएस कोशिकाओं द्वारा स्रावित कारक प्रतिरक्षा चोरी या मेटास्टेसिस4,5 को बढ़ावा देकर ट्यूमर घातकता को बढ़ा सकते हैं। टीआईएस कोशिकाएं जटिल, संदर्भ-विशिष्ट फेनोटाइप, परिवर्तित चयापचय प्रोफाइल और अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं विकसित करती हैं 6,7,8। इसलिए, विभिन्न कैंसर उपचार दृष्टिकोणों द्वारा प्रेरित टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और लक्षण वर्णन कैंसर अनुसंधान समुदाय के लिए चल रही रुचि का विषय है।
टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, पारंपरिक सेनेसेंस परख का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, मुख्य रूप से सेनेसेंस मार्कर एंजाइम, लाइसोसोमल बीटा-गैलेक्टोसिडेस जीएलबी 19 की बढ़ती गतिविधि का पता लगाने के आधार पर। निकट-तटस्थ (अम्लीय के बजाय) लाइसोसोमल पीएच पर पता लगाने से सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस (एसए-β-गैल) 10 का विशिष्ट पता लगाने की अनुमति मिलती है। एक मानक एसए-β-गैल परख जिसका उपयोग कई दशकों से किया जा रहा है, प्रकाश माइक्रोस्कोपी11 द्वारा निश्चित कोशिकाओं में एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए एक्स-गैल (5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-β-डी-गैलेक्टोपायरानोसाइड), एक नीले क्रोमोजेनिक बीटा-गैलेक्टोसिडेस सब्सट्रेट का उपयोग करता है। एक्स-गैल परख आमतौर पर उपलब्ध अभिकर्मकों और प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके टीआईएस की गुणात्मक दृश्य पुष्टि की अनुमति देती है। एक बुनियादी संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोप नीले क्रोमोजेन की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक एकमात्र उपकरण है। हालांकि, एक्स-गैल स्टेनिंग प्रक्रिया में संवेदनशीलता की कमी हो सकती है, कभी-कभी रंग विकसित करने के लिए 24 घंटे से अधिक की आवश्यकता होती है। धुंधलापन के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नीले क्रोमोजेन की तीव्रता के कुछ स्तर का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं की गिनती के आधार पर व्यक्तिगत सेनेसेंट कोशिकाओं का कम-थ्रूपुट, व्यक्तिपरक स्कोरिंग होता है। चूंकि एक्स-गैल सेल-अभेद्य है, इस परख को विलायक-निश्चित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, जिसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता है। जानवरों या रोगियों के सीमित नमूनों के साथ काम करते समय, यह एक बड़ी खामी हो सकती है।
सेल-परगम्य, फ्लोरोसेंट एंजाइम सब्सट्रेट्स का उपयोग करके बेहतर एसए-β-गैल परख, जिसमें सी12-एफडीजी (5-डोडेकैनोइलामिनोफ्लोरेसिन डी-β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड, ग्रीन) और डीडीएओजी (9एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन-7-वाईएल) β-डी-गैलेक्टोपाइरानोसाइड, दूर-लाल) शामिल हैं। डीडीएओजी की रासायनिक जांच संरचना और ऑप्टिकल विशेषताओं को पूरक चित्र एस 1 में दिखाया गया है। ये सेल-परगम्य जांच जीवित (निश्चित के बजाय) कोशिकाओं के विश्लेषण की अनुमति देती है, और क्रोमोजेनिक जांच के बजाय फ्लोरोसेंट तेजी से उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट विश्लेषण प्लेटफार्मों के उपयोग की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसमें उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग उपकरण और प्रवाह साइटोमीटर शामिल हैं। सॉर्टिंग फ्लो साइटोमीटर डाउनस्ट्रीम विश्लेषण (जैसे, पश्चिमी सोख्ता, एलिसा, या ‘ओमिक्स) के लिए सेल संस्कृतियों या ट्यूमर से जीवित सेनेसेंट कोशिकाओं की समृद्ध आबादी की वसूली को सक्षम करता है। प्रतिदीप्ति विश्लेषण एक मात्रात्मक संकेत भी प्रदान करता है, जिससे किसी दिए गए नमूने के भीतर सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत का अधिक सटीक निर्धारण हो सकता है। व्यवहार्यता जांच और फ्लोरोफोरे-लेबल एंटीबॉडी सहित अतिरिक्त फ्लोरोसेंट जांच, एसए-β-गैल से परे लक्ष्यों के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए आसानी से जोड़ा जा सकता है।
डीडीएओजी के समान, सी12-एफडीजी एसए-β-गैल के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच है, लेकिन इसका हरा फ्लोरोसेंट उत्सर्जन आंतरिक सेलुलर एएफ के साथ ओवरलैप होता है, जो कोशिकाओं16 में लिपोफसिन समुच्चय के संचय के कारण सेनेसेंस के दौरान उत्पन्न होता है। दूर-लाल डीडीएओजी जांच का उपयोग करके, हरे सेलुलर एएफ को सेनेसेंस17 की पुष्टि करने के लिए द्वितीयक पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह एसए-β-गैल के अलावा एक दूसरे मार्कर का उपयोग करके परख विश्वसनीयता में सुधार करता है, जो अक्सर सेनेसेंस18 के लिए एकल मार्कर के रूप में अविश्वसनीय हो सकता है। चूंकि सेनेसेंट कोशिकाओं में अंतर्जात एएफ का पता लगाना एक लेबल-मुक्त दृष्टिकोण है, इसलिए यह हमारे डीडीएओजी-आधारित परख की विशिष्टता का विस्तार करने का एक तेज़ और सरल तरीका है।
इस प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो संस्कृतियों से व्यवहार्य टीआईएस ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान के लिए एक तेजी से, दोहरे पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री परख के रूप में डीडीएओजी और एएफ के उपयोग का प्रदर्शन करते हैं या चूहों में स्थापित दवा-उपचारित ट्यूमर से अलग होते हैं (चित्रा 1)। प्रोटोकॉल मानक वाणिज्यिक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषक और सॉर्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत फ्लोरोफोर का उपयोग करता है (तालिका 1)। मानक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं के प्रतिशत की मात्रा सक्षम है। यदि वांछित हो, तो सेनेसेंस के साथ समवर्ती रूप से रुचि के सेल सतह एंटीजन का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक इम्यूनोलेबलिंग चरण किया जा सकता है। पहचाने गए सेनेसेंट कोशिकाओं को मानक प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) पद्धति का उपयोग करके भी समृद्ध किया जा सकता है।
चित्र 1: प्रायोगिक वर्कफ़्लो. डीडीएओजी परख के प्रमुख बिंदुओं का एक योजनाबद्ध सारांश। (ए) एक टीआईएस-उत्प्रेरण दवा स्तनधारी सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ी जाती है या ट्यूमर-असर चूहों को प्रशासित की जाती है। टीआईएस की शुरुआत के लिए समय की अनुमति दी जाती है: कोशिकाओं के लिए, उपचार के 4 दिन बाद; चूहों के लिए, कुल 22 दिन, हर 5 दिनों में तीन उपचार और 7 दिन की वसूली के साथ। कोशिकाओं को काटा जाता है या ट्यूमर को निलंबन में अलग कर दिया जाता है। (बी) 30 मिनट के लिए एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए लाइसोसोमल पीएच को समायोजित करने के लिए बीएएफ के साथ नमूने का इलाज किया जाता है; फिर, एसए-β-गैल का पता लगाने के लिए 60 मिनट के लिए डीडीएओजी जांच को जोड़ा जाता है। नमूने पीबीएस में 2x धोए जाते हैं, और एक व्यवहार्यता दाग संक्षेप में जोड़ा जाता है (15 मिनट)। वैकल्पिक रूप से, नमूने खुले प्रतिदीप्ति चैनलों में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग दिए जा सकते हैं और / या बाद के विश्लेषण के लिए तय किए जा सकते हैं। (सी) नमूने एक मानक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। व्यवहार्य कोशिकाओं को लाल डीडीएओजी (एसए-β-गैल का संकेत) बनाम हरे ऑटोफ्लोरेसेंस (लिपोफसिन) को दिखाते हुए डॉट प्लॉट्स में देखा जाता है। टीआईएस कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए एक गेट अनुपचारित नियंत्रण नमूनों (नहीं दिखाया गया) के आधार पर स्थापित किया गया है। यदि एक सॉर्टिंग साइटोमीटर (एफएसीएस) का उपयोग किया जाता है, तो टीआईएस कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और आणविक जीव विज्ञान परख के लिए आगे इन विट्रो परख या लाइस और संसाधित करने के लिए संस्कृति में वापस रखा जा सकता है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; टीआईएस = चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस; एफएल-एबी = फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी; बाफ = बाफिलोमाइसिन ए 1; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| फ्लोरोफोरे | पाता | एक्स/ईएम (एनएम) | साइटोमीटर लेजर (एनएम) | साइटोमीटर डिटेक्टर / बैंडपास फिल्टर (एनएम) |
| डीडीएओजी | एसए-β-गैल | 645/6601 | 640 | 670 / 30 |
| वायुसेना | लिपोफुसिन | < 600 | 488 | 525 / 50 |
| CV450 | व्यावहारिकता | 408/450 | 405 | 450 / 50 |
| पीई | एंटीबॉडी/ सतह मार्कर | 565/578 | 561 | 582 / 15 |
तालिका 1: फ्लोरोफोरेस और साइटोमीटर ऑप्टिकल विनिर्देश। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले साइटोमीटर विनिर्देशों को कुल 4 लेजर और 15 उत्सर्जन डिटेक्टरों के साथ एक उपकरण के लिए सूचीबद्ध किया गया है। 645/660 एनएम पर पाया गया डीडीएओजी एसए-β-गैल1 द्वारा की गई जांच का रूप है। अशुद्ध डीडीएओजी 460/610 एनएम पर निम्न स्तर की प्रतिदीप्ति प्रदर्शित कर सकता है लेकिन प्रोटोकॉल में धोने के चरणों द्वारा हटा दिया जाता है। संक्षेप: डीडीएओ = 9 एच-(1,3-डाइक्लोरो-9,9-डाइमिथाइलक्रिडिन-2-वन); डीडीएओजी = डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड; एएफ = ऑटोफ्लोरेसेंस; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एसए-β-गैल = सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले एक दशक में, ट्यूमर इम्यूनोलॉजी की उभरती लोकप्रियता, कम लागत वाले प्रवाह साइटोमीटर के विकास और शैक्षणिक संस्थानों में साझा इंस्ट्रूमेंटेशन सुविधाओं में सुधार के कारण फ्लो साइटोमेट्री कैंसर अन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फ्लो साइटोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन पर समर्थन के लिए शिकागो विश्वविद्यालय में साइटोमेट्री और एंटीबॉडी कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। शिकागो विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान केंद्र ने पशु आवास प्रदान किया।
Materials
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Bleomycin sulfate | Cayman | 13877 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM viability dye | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 antibody, PE conjugate | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| Cell line: A549 human lung adenocarcinoma | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Cell line: B16-F10 mouse melanoma | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Cell scraper | Corning | 3008 | |
| Cell strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc receptor blocking reagent | Biolegend | 101320 | Anti-mouse CD16/32 |
| Flow cytometer (cell analyzer) | Becton Dickinson (BD) | Various | LSRFortessa |
| Flow cytometer (cell sorter) | Becton Dickinson (BD) | Various | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium) |
| Rainbow calibration particles, ultra kit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 µm, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Sodium chloride 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Contact BD for license |
| Software for cytometer data analysis, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Contact TreeStar for license |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Life Technologies | 25200-114 |
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