Far-Red Fluorescerende Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for identifisering og anrikning av Senescent tumorceller ved flowcytometri

Summary

En protokoll for fluorescerende, flowcytometrisk kvantifisering av senescent kreftceller indusert av kjemoterapi narkotika i cellekultur eller i murine tumor modeller presenteres. Valgfrie prosedyrer inkluderer co-immunostaining, prøvefiksering for å lette stor batch- eller tidspunktanalyse, og anrikning av levedyktige senescentceller ved flowcytometrisk sortering.

Abstract

Cellulær senescens er en tilstand av proliferativ arrestasjon indusert av biologisk skade som normalt påløper over år i aldrende celler, men kan også dukke opp raskt i tumorceller som et svar på skade forårsaket av ulike kreftbehandlinger. Tumorcellesenescens anses generelt som uønsket, da senescentceller blir resistente mot død og blokkerer tumorremisjon mens de forverrer tumormalignitet og behandlingsresistens. Derfor er identifisering av senescent tumorceller av pågående interesse for kreftforskningsmiljøet. Ulike senescence analyser eksisterer, mange basert på aktiviteten til den velkjente senescence markøren, senescence-assosiert beta-galactosidase (SA-β-Gal).

Vanligvis utføres SA-β-Gal-analysen ved bruk av et kromogent substrat (X-Gal) på faste celler, med langsom og subjektiv oppregning av “blå” senescentceller ved lysmikroskopi. Forbedrede analyser ved bruk av cellepermeante, fluorescerende SA-β-Gal-substrater, inkludert C_12-FDG (grønn) og DDAO-Galactoside (DDAOG; langt rød), har gjort det mulig å analysere levende celler og tillatt bruk av fluorescerende analyseplattformer med høy gjennomstrømning, inkludert flowcytometre. C_12-FDG er en veldokumentert sonde for SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende utslipp overlapper med egen cellulær autofluorescens (AF) som oppstår under senescens på grunn av akkumulering av lipofuscinaggregater. Ved å bruke den langt røde SA-β-Gal-sonden DDAOG, kan grønn cellulær autofluorescens brukes som en sekundær parameter for å bekrefte senescence, noe som gir pålitelighet til analysen. De resterende fluorescenskanalene kan brukes til celle levedyktighet farging eller valgfri fluorescerende immunmerking.

Ved hjelp av flowcytometri demonstrerer vi bruken av DDAOG og lipofuscin autofluorescens som en dual-parameter analyse for identifisering av senescent tumorceller. Kvantifisering av prosentandelen av levedyktige senescentceller utføres. Om ønskelig kan et valgfritt immunmerkingstrinn inkluderes for å evaluere celleoverflateantigener av interesse. Identifiserte senescentceller kan også flyte cytometrisk sortert og samlet for nedstrøms analyse. Oppsamlede senescentceller kan umiddelbart lyses (f.eks. for immunoassays eller ‘omics analyse) eller videre dyrket.

Introduction

Senescent celler akkumuleres normalt i organismer over år under normal biologisk aldring, men kan også utvikle seg raskt i tumorceller som et svar på skade forårsaket av ulike kreftbehandlinger, inkludert stråling og kjemoterapi. Selv om det ikke lenger sprer seg, kan terapiinduserte senescent (TIS) tumorceller bidra til behandlingsresistens og drive tilbakefall ^1,2,3. Faktorer utskilt av TIS-celler kan forverre tumor malignitet ved å fremme immununnvikelse eller metastase ^4,5. TIS-celler utvikler komplekse, kontekstspesifikke fenotyper, endrede metabolske profiler og unike immunresponser ^6,7,8. Derfor er identifisering og karakterisering av TIS-tumorceller indusert av ulike kreftbehandlingsmetoder et tema av kontinuerlig interesse for kreftforskningsmiljøet.

For å oppdage TIS-tumorceller er konvensjonelle senescensanalyser mye brukt, hovedsakelig basert på å oppdage økt aktivitet av senescensmarkørenzymet, den lysosomale beta-galaktosidase GLB1⁹. Deteksjon ved en nesten nøytral (snarere enn sur) lysosomal pH muliggjør spesifikk påvisning av senescensassosiert beta-galaktosidase (SA-β-Gal)¹⁰. En standard SA-β-Gal-analyse som har blitt brukt i flere tiår, bruker X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), et blått kromogent beta-galaktosidasesubstrat, for å oppdage SA-β-Gal i faste celler ved lysmikroskopi¹¹. X-Gal-analysen tillater kvalitativ visuell bekreftelse av TIS ved bruk av allment tilgjengelige reagenser og laboratorieutstyr. Et grunnleggende overført lysmikroskop er den eneste instrumenteringen som kreves for å evaluere tilstedeværelsen av det blå kromogenet. Imidlertid kan X-Gal-fargeprosedyren mangle følsomhet, noen ganger krever mer enn 24 timer for at farge skal utvikle seg. Farging etterfølges av lav gjennomstrømning, subjektiv scoring av individuelle senescentceller basert på å telle cellene som viser et visst intensitetsnivå av det blå kromogenet under et lysmikroskop. Siden X-Gal er celle-ugjennomtrengelig, krever denne analysen løsemiddelfikserte celler, som ikke kan gjenopprettes for nedstrømsanalyse. Ved arbeid med begrensede prøver fra dyr eller pasienter kan dette være en stor ulempe.

Forbedrede SA-β-Gal-analyser ved bruk av cellepermeante, fluorescerende enzymsubstrater, inkludert C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, grønn) og DDAOG (9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en-7-yl) β-D-Galactopyranoside, langt rød) har tidligere dukket opp i litteraturen^12,13,14,15. Den kjemiske sondestrukturen og optiske egenskapene til DDAOG er vist i tilleggsfigur S1. Disse celle-permeant sonder tillater analyse av levende (snarere enn faste) celler, og fluorescerende snarere enn kromogene prober lette bruken av raske high-throughput fluorescerende analyseplattformer, inkludert høyinnhold screening instrumenter og flow cytometre. Sortering av flowcytometre muliggjør gjenoppretting av berikede populasjoner av levende senescentceller fra cellekulturer eller svulster for nedstrøms analyse (f.eks. Western blotting, ELISA eller ‘omics). Fluorescensanalyse gir også et kvantitativt signal, noe som muliggjør mer nøyaktig bestemmelse av prosentandelen av senescentceller i en gitt prøve. Ytterligere fluorescerende prober, inkludert levedyktighetssonder og fluoroformerkede antistoffer, kan lett legges til for multiplekset analyse av mål utover SA-β-Gal.

I likhet med DDAOG er C_12-FDG en fluorescerende sonde for SA-β-Gal, men dens grønne fluorescerende utslipp overlapper med inneboende cellulær AF, som oppstår under aldring på grunn av akkumulering av lipofuscinaggregater i celler¹⁶. Ved å bruke den langt røde DDAOG-sonden, kan grønn cellulær AF brukes som en sekundær parameter for å bekrefte senescence¹⁷. Dette forbedrer analysepåliteligheten ved å bruke en annen markør i tillegg til SA-β-Gal, som ofte kan være upålitelig som en enkelt markør for senescence¹⁸. Siden deteksjon av endogen AF i senescentceller er en etikettfri tilnærming, er det en rask og enkel måte å utvide spesifisiteten til vår DDAOG-baserte analyse.

I denne protokollen demonstrerer vi bruken av DDAOG og AF som en rask, dual-parameter flowcytometrianalyse for identifisering av levedyktige TIS-tumorceller fra in vitro-kulturer eller isolert fra legemiddelbehandlede svulster etablert hos mus (figur 1). Protokollen bruker fluoroforer som er kompatible med et bredt spekter av standard kommersielle flowcytometrianalysatorer og sorteringsmaskiner (tabell 1). Kvantifisering av prosentandelen av levedyktige senescentceller ved bruk av standard flowcytometrianalyse er aktivert. Om ønskelig kan et valgfritt immunmerkingstrinn utføres for å evaluere celleoverflateantigener av interesse samtidig med senescens. Identifiserte senescentceller kan også berikes ved hjelp av standard fluorescensaktivert cellesortering (FACS) metodikk.

Figur 1: Eksperimentell arbeidsflyt. En skjematisk oppsummering av nøkkelpunkter i DDAOG-analysen. (A) Et TIS-induserende legemiddel tilsettes pattedyrdyrkede celler eller administreres til tumorbærende mus. Tid er da tillatt for utbruddet av TIS: for celler, 4 dager etter behandling; For mus, 22 dager totalt, med tre behandlinger hver 5. dag pluss 7 dager utvinning. Celler høstes eller svulster dissosieres til suspensjon. (B) Prøver behandles med Baf for å justere lysosomal pH for påvisning av SA-β-Gal i 30 minutter; deretter legges DDAOG-sonden til i 60 minutter for å oppdage SA-β-Gal. Prøver vaskes 2x i PBS, og en levedyktighetsflekk tilsettes kort (15 min). Eventuelt kan prøver farges med fluorescerende antistoffer i åpne fluorescenskanaler og / eller fikses for senere analyse. (C) Prøver analyseres ved hjelp av et standard flowcytometer. Levedyktige celler visualiseres i punktplott som viser rød DDAOG (indikerer SA-β-Gal) versus grønn autofluorescens (lipofuscin). En port for å bestemme prosentandelen av TIS-celler er etablert basert på ubehandlede kontrollprøver (ikke vist). Hvis et sorteringscytometer (FACS) brukes, kan TIS-celler samles og plasseres tilbake i kultur for videre in vitro-analyser eller lyses og behandles for molekylærbiologiske analyser. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = terapi-indusert senescence; FL-Ab = fluorofor-konjugert antistoff; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = senescence-assosiert beta-galaktosidase; PBS = fosfatbufret saltvann; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Fluorophore	Oppdager	Eks/Em (nm)	Cytometer laser (nm)	Cytometer detektor / båndpassfilter (nm)
DDAOG	SA-β-Gal	645/6601	640	670 / 30
AF	Lipofuscin	< 600	488	525 / 50
CV450	Levedyktighet	408/450	405	450 / 50
PE	Antistoff/overflatemarkør	565/578	561	582 / 15

Tabell 1: Fluoroforer og cytometer optiske spesifikasjoner. Cytometerspesifikasjoner som brukes i denne protokollen er oppført for et instrument med totalt 4 lasere og 15 utslippsdetektorer. DDAOG oppdaget ved 645/660 nm er formen av sonden spaltet av SA-β-Gal¹. Uncleaved DDAOG kan vise lavt nivå fluorescens ved 460/610 nm, men fjernes ved vask trinn i protokollen. Forkortelser: DDAO = 9H- (1,3-diklor-9,9-dimetylacridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescens; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = senescence-assosiert beta-galaktosidase.

Protocol

Alt dyrearbeid som ble beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Chicago. 1. Klargjøring og lagring av lagerløsninger MERK: Hvis cellene skal flytsorteres, skal alle løsninger fremstilles ved hjelp av sterile teknikker og filtreres gjennom en 0,22 μm filteranordning. Klargjør en stamløsning av DDAO-Galactoside ved 5 mg/ml i DMSO. Aliquot ved 50 μL per rør (eller ønsket volum). Oppbevar…

Representative Results

Flere eksperimenter ble utført for å demonstrere sammenlignbarheten av DDAOG til X-Gal og C12-FDG for påvisning av senescens av SA-β-Gal. Først ble X-Gal brukt til å farge senescent B16-F10 melanomceller indusert av ETO (figur 2A). En intens blå farge utviklet seg i en delmengde av ETO-behandlede celler, mens andre celler viste mindre intens blå farging. Morfologi ble forstørret i de fleste ETO-behandlede celler. Farging av ETO-behandlede celler med fluorescerende SA-β-G…

Discussion

I løpet av det siste tiåret eller så har flowcytometri blitt en mer vanlig analyseplattform i kreftforskning på grunn av den fremvoksende populariteten til tumorimmunologi, utvikling av billigere flowcytometre og forbedring av delte instrumenteringsfasiliteter ved akademiske institusjoner. Flerfargede analyser er nå standard, da de fleste nyere instrumenter er utstyrt med fiolette, blågrønne og røde til langt røde optiske arrays. Dermed vil denne DDAOG-protokollen sannsynligvis være kompatibel med et bredt spek…

Materials

Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114