Undersøgelse af funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 ved hjælp af Western Blotting

Summary

Den nuværende protokol fremhæver anvendelsen af western blotting teknik til at studere funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøgelsen af KCC2-phosphorylering på kinaseregulerende steder Thr906/1007 via western blotting. Yderligere metoder til bekræftelse af KCC2-aktivitet er også kort fremhævet i denne tekst.

Abstract

Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC’er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning. Manglende korrekt regulering af KCC2 er skadelig og har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi. Der er sket betydelige fremskridt med hensyn til at forstå de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Her fremhæver protokollen, hvordan man undersøger KCC2-fosforylering på kinaseregulerende steder – Thr906 og Thr1007 – ved hjælp af western blotting-teknik. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase. Et par af disse yderligere teknikker vil kort blive diskuteret i dette manuskript.

Introduction

Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC’er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at ^{Cl-homeostase} fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning 1,2,3,4. Vedligeholdelsen af lav intraneuronal Cl-koncentration ([Cl-]i) ved 4-6 mM ved KCC2 letter ^{γ-aminosmørsyre} (GABA)/glycinhyperpolarisering og synaptisk hæmning i hjernen og rygmarven⁵. Manglende korrekt regulering af KCC2 har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi⁴. Desuden har nedsat KCC2-medieret ^{Cl-ekstrudering} og nedsat hyperpolariserende GABA_A og / eller glycinreceptormedierede strømme været impliceret i epilepsi, neuropatisk smerte og spasticitet ^6,7. Neuronal KCC2 moduleres negativt via phosphorylering af vigtige regulatoriske rester inden for dets C-terminale intracellulære domæne af det med-ingen-lysin (WNK)-STE20 / SPS1-relaterede prolin / alaninrige (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinasesignalkompleks¹, hvilket letter vedligeholdelsen af depolariseret GABA-aktivitet i umodne neuroner ^2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1 phosphorylerer threoninrester 906 og 1007 (Thr906 / Thr1007) og nedregulerer efterfølgende mRNA-genekspression af KCC2, hvilket fører til en deraf følgende forringelse af dets fysiologiske funktion ^8,10. Endnu vigtigere er det imidlertid allerede en kendsgerning, at WNK-SPAK / OSR1 kinasekomplekset er kendt for phosphorylat og hæmmer KCC2-ekspression 1,2,4,11,12, og at inhiberingen af kinasekompleksets signalveje til phosphorylat Thr906 / Thr1007 har været forbundet med den øgede ekspression af KCC2 mRNA-genet ^13,14,15 . Det er vigtigt at bemærke, at reguleringen af neuronal KCC2 og Na⁺-K⁺-2Cl^– cotransporters 1 (NKCC1) ekspression via proteinfosforylering virker samtidigt og i omvendte mønstre ^1,4,16.

Der er sket konsekvente og betydelige fremskridt med hensyn til forståelsen af de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, og som er akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Protokollen, der præsenteres her, fremhæver anvendelsen af western blotting-teknikker til at studere funktionerne og aktiviteterne hos neuronal K ⁺-Cl-co-transporter KCC2 ved at undersøge phosphorylering af cotransporteren på kinaseregulerende steder Thr906/1007.

Western blot er en metode, der bruges til at detektere specifikke proteiner af interesse fra en prøve af væv eller celle. Denne metode adskiller først proteinerne efter størrelse gennem elektroforese. Proteinerne overføres derefter elektroforetisk til en fast støtte (normalt en membran), før målproteinet markeres ved hjælp af et specifikt antistof. Antistofferne er konjugeret til forskellige tags eller fluorophorekonjugerede antistoffer, der detekteres ved hjælp af enten kolorimetriske, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Dette gør det muligt at detektere et specifikt målprotein fra en blanding af proteiner. Denne teknik er blevet brugt til at karakterisere fosfospecifikke steder i KCCs¹ og er blevet brugt til at identificere kinasehæmmere, der hæmmer KCC3 Thr991 / Thr1048 phosphorylation¹⁷. Ved at følge denne protokol kan man specifikt detektere total og phosphoryleret KCC2 fra celle / væv lysater. I princippet er påvisning af proteinkonjugerede antistoffer ved hjælp af denne teknik meget instrumentel, da det hjælper med at forbedre forståelsen af samarbejdsaktiviteter på phospho-stederne i KCC2, hvilket kaster lys over de molekylære mekanismer, der er involveret i deres fysiologiske reguleringer. Den kvantitative analyse af det samlede proteinekspression er repræsentativt for KCC2’s funktion og aktivitet. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen beskriver western blotting-metoden til påvisning af specifikke proteiner af interesse. 1. Cellekultur og transfektion Varm alle reagenserne i perlebadet (37 °C) op inden celledyrkningsproceduren. Forbered kulturmedium, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% hver af 2mM L-glutamin, 100x ikke-essentiel aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheder / ml penicillin-streptomycin. Optøning af …

Representative Results

Her undersøgte det repræsentative resultat, der blev præsenteret i figur 1, virkningen af staurosporin og NEM på WNK-SPAK / OSR1 medieret phosphorylering af KCC2 og NKCC1 i HEK293 cellelinjer, der stabilt udtrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjælp af western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de repræsentative resultater diskuteres i Zhang et al.15. I lighed med NAM er staurosporin en bred kinasehæmmer, der kan …

Discussion

Mange metoder er blevet brugt til at måle aktiviteterne i SLC12 af CCC’er, der udtrykkes i neuronerne, herunder KCC2. Mange af disse teknikker har vist sig at forbedre den videnskabelige viden om analysen af disse transportørers funktionelle relevans og deres strukturfunktionsmønstre i forskellige sygdomsrelaterede mutationer. Kritisk er der fordele og forbehold ved de forskellige metoder²¹. Protokollen forklaret ovenfor skitserede imidlertid, hvordan man vurderer KCC2-phosphorylering på kinas…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions