Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.
Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kation-chloride-cotransporters (CCC’s), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is schadelijk en is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrijpen van de mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Hier benadrukt het protocol hoe KCC2-fosforylering op kinase-regulerende locaties – Thr906 en Thr1007 – kan worden onderzocht met behulp van western blotting-techniek. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase. Een paar van deze aanvullende technieken zullen in dit manuscript kort worden besproken.
Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kationchloride-cotransporters (CCC’s), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming 1,2,3,4. Het behoud van een lage intraneuronale Cl-concentratie ([Cl–]i) bij 4-6 mM door KCC2 vergemakkelijkt γ-aminoboterzuur (GABA)/glycine hyperpolarisatie en synaptische remming in de hersenen en het ruggenmerg5. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie4. Bovendien zijn verminderde KCC2-gemedieerde Cl− extrusie en verminderde hyperpolariserende GABAA en/of glycine receptor-gemedieerde stromen betrokken bij epilepsie, neuropathische pijn en spasticiteit 6,7. Neuronale KCC2 wordt negatief gemoduleerd via fosforylering van belangrijke regulerende residuen binnen zijn C-terminale intracellulaire domein door het met-geen-lysine (WNK)-STE20/SPS1-gerelateerde proline/alanine-rijke (SPAK)/oxidatieve stress-responsieve (OSR) kinase signaleringscomplex1, wat het behoud van gedepolariseerde GABA-activiteit in onrijpe neuronenvergemakkelijkt 2,8,9 . De WNK-SPAK/OSR1 fosforyleert threonineresiduen 906 en 1007 (Thr906/Thr1007) en downreguleert vervolgens de mRNA-genexpressie van KCC2, wat leidt tot een daaruit voortvloeiende verslechtering van de fysiologische functie 8,10. Belangrijker is echter dat het al een feit is dat van het WNK-SPAK/OSR1-kinasecomplex bekend is dat het KCC2-expressie 1,2,4,11,12 fosforylaat en remt, en dat de remming van de kinasecomplexsignaleringsroutes naar fosforylaat Thr906/Thr1007 in verband is gebracht met de verhoogde expressie van het KCC2 mRNA-gen 13,14,15 . Het is belangrijk op te merken dat de regulatie van neuronale KCC2 en Na+-K+-2Cl– cotransporters 1 (NKCC1) expressie via eiwitfosforylering gelijktijdig en in omgekeerde patronen werkt 1,4,16.
Er is consistente en aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrip van mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Het hier gepresenteerde protocol benadrukt de toepassing van western blotting-technieken om de functies en activiteiten van neuronale K +-Cl– co-transporter KCC2 te bestuderen door de fosforylering van de cotransporter op kinase-regelgevende locaties Thr906/1007 te onderzoeken.
Western blot is een methode die wordt gebruikt om specifieke eiwitten van belang te detecteren uit een monster van weefsel of cel. Deze methode scheidt de eiwitten eerst op grootte door middel van elektroforese. De eiwitten worden vervolgens elektroforetisch overgebracht naar een vaste ondersteuning (meestal een membraan) voordat het doeleiwit wordt gemarkeerd met behulp van een specifiek antilichaam. De antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende tags of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen die worden gedetecteerd met behulp van colorimetrische, chemiluminescentie of fluorescentiemethoden. Hierdoor kan een specifiek doeleiwit worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Deze techniek is gebruikt om fosfospecifieke locaties van KCCCs1 te karakteriseren en is gebruikt om kinaseremmers te identificeren die KCC3 Thr991/Thr1048 fosforyleringremmen 17. Door dit protocol te volgen, kan men specifiek totaal en gefosforyleerd KCC2 detecteren uit cel/weefsellysaten. In principe is de detectie van eiwit-geconjugeerde antilichamen door deze techniek zeer instrumenteel omdat het helpt om het begrip van samenwerkingsactiviteiten op de fosfo-locaties van KCC2 te verbeteren, wat licht werpt op de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hun fysiologische regulaties. De kwantitatieve analyse van de totale eiwitexpressie is representatief voor de functie en activiteit van KCC2. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase.
Veel methoden zijn gebruikt om de activiteiten van SLC12 van CCC’s te meten die tot expressie komen in de neuronen, waaronder KCC2. Veel van deze technieken hebben bewezen de wetenschappelijke kennis te vergroten over de analyse van de functionele relevantie van deze transporters en hun structuur-functiepatronen in verschillende ziektegerelateerde mutaties. Kritisch zijn er voordelen en kanttekeningen bij de verschillende methoden21. Het hierboven uitgelegde protocol schetste echter hoe KCC2-fosfo…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) en een Commonwealth Ph.D. Scholarship.
40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
Gel Blotting – Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |