חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

Abstract

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl^– הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergic פונקציונלי. כישלון בוויסות תקין של KCC2 הוא מזיק ונקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה. חלה התקדמות ניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). כאן, הפרוטוקול מדגיש כיצד לחקור זרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז – Thr906 ו- Thr1007 – באמצעות טכניקת כתם מערבית. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי. כמה מהטכניקות הנוספות הללו יידונו בקצרה בכתב יד זה.

Introduction

אשלגן כלורי cotransporters 2 (KCC2) הוא חבר במשפחת נשאים מומסים 12 (SLC12) של קטיון-כלוריד-cotransporters (CCCs), הנמצא באופן בלעדי בנוירון והוא חיוני לתפקוד תקין של Cl^– הומאוסטזיס וכתוצאה מכך עיכוב GABAergic^תפקודי 1,2,3,4. שמירה ^{על ריכוז Cl} תוך-עצבי נמוך ([Cl-_]i) ב-4-6 mM על-ידי KCC2 מקלה על γ-חומצה אמינו-בוטירית (GABA)/גליצין היפרפולריזציה ועיכוב סינפטי במוח ובחוט השדרה⁵. כישלון בוויסות תקין של KCC2 נקשר לשכיחות של מספר מחלות נוירולוגיות, כולל אפילפסיה⁴. יתר על כן, ירידה בשחול Cl⁻ בתיווך KCC2 ופגיעה בהיפר-פולריזציה של GABA_A ו/או זרמים בתיווך קולטן גליצין היו מעורבים באפילפסיה, כאב נוירופתי וספסטיות ^6,7. KCC2 עצבי מווסת באופן שלילי באמצעות זרחון של שאריות רגולטוריות מרכזיות בתחום התוך-תאי של מסוף C שלו על-ידי פרולין/אלנין (SPAK)/קומפלקס קינאז חמצוני מגיב לעקה חמצונית (OSR), המאפשר שמירה על פעילות GABA דה-פולריזציה בתאי עצב לא בשלים 2,8,9 . הזרחון WNK-SPAK/OSR1 משמיט שאריות תראונין 906 ו-1007 (Thr906/Thr1007) ולאחר מכן מפחית את ביטוי הגן mRNA של KCC2, מה שמוביל להידרדרות בתפקוד הפיזיולוגי שלו ^8,10. חשוב מכך, עם זאת, זו כבר עובדה שקומפלקס הקינאז WNK-SPAK/OSR1 ידוע כזרחן ומעכב ביטוי KCC2 1,2,4,11,12, וכי העיכוב של מסלולי האיתות המורכבים של קינאז לזרחן Thr906/Thr1007 נקשר לביטוי מוגבר של הגן KCC2 mRNA^13,14,15 . חשוב לציין כי ויסות הביטוי העצבי KCC2 ו-Na+-K⁺-2Cl^– cotransporters 1 (NKCC1) באמצעות זרחון חלבונים פועל במקביל ובתבניות מנוגדות ^1,4,16.

חלה התקדמות עקבית וניכרת בכל הנוגע להבנת המנגנונים המעורבים ברגולציה של KCC2, המוסמכים לפיתוח טכניקות המאפשרות לחוקרים לחקור את תפקידיו ופעילויותיו; או באמצעות חקירות ישירות (הערכת פוספורילציה באתרים רגולטוריים של קינאז) או בעקיפין (תצפית וניטור פעילות GABA). הפרוטוקול המוצג כאן מדגיש את היישום של טכניקות הכתמה המערביות כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של K⁺-Cl^– טרנספורטר משותף עצבי KCC2 על ידי חקירת הזרחון של הקוטרנספורטר באתרי הרגולציה של קינאז Thr906/1007.

כתם מערבי הוא שיטה המשמשת לזיהוי חלבונים ספציפיים בעלי עניין מדגימה של רקמה או תא. שיטה זו מפרידה תחילה את החלבונים לפי גודל באמצעות אלקטרופורזה. לאחר מכן החלבונים מועברים אלקטרופורטית לתמיכה מוצקה (בדרך כלל קרום) לפני שחלבון המטרה מסומן באמצעות נוגדן ספציפי. הנוגדנים מצומדים לתגים שונים או לנוגדנים מצומדים לפלואורופור המזוהים באמצעות שיטות colorimetric, chemiluminescence או פלואורסצנטיות. זה מאפשר לזהות חלבון מטרה ספציפי מתערובת של חלבונים. טכניקה זו שימשה לאפיון אתרים זרחניים של KCCs¹ ושימשה לזיהוי מעכבי קינאז המעכבים זרחון KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לזהות באופן ספציפי KCC2 כולל וזרחני מליסאטות תאים/רקמות. באופן עקרוני, זיהוי נוגדנים מצומדים לחלבון בטכניקה זו הוא בעל חשיבות רבה מכיוון שהוא מסייע לשפר את ההבנה של פעילויות שיתופיות באתרי הפוספו של KCC2, אשר שופך אור על המנגנונים המולקולריים המעורבים בתקנות הפיזיולוגיות שלהם. הניתוח הכמותי של ביטוי החלבון הכולל מייצג את הפונקציה והפעילות של KCC2. ישנן שיטות קלאסיות אחרות המשמשות למדידה ישירה של פעילות KCC2, כגון יון רובידיום ובדיקת ספיגת יוני תליום. טכניקות נוספות כגון טלאי-מהדק-אלקטרופיזיולוגיה משמשות למדידת פעילות GABA; לפיכך, משקף בעקיפין KCC2 מופעל ו / או מומת כפי שנודע על ידי הערכה של הומאוסטזיס יון כלוריד תוך תאי.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מתאר את שיטת הכתם המערבית לאיתור חלבונים ספציפיים בעלי עניין. 1. תרבית תאים וטרנספקציה חממו את כל הריאגנטים באמבט החרוזים (37 מעלות צלזיוס) לפני הליך תרבית התאים. הכינו מדיום תרבית, מדיום נשר מעובד (DMEM) של Dulbecco, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% כל אחד של 2…

Representative Results

כאן, התוצאה המייצגת המוצגת באיור 1 חקרה את ההשפעה של סטאורוספורין ו-NEM על זרחון מתווך WNK-SPAK/OSR1 של KCC2 ו-NKCC1 בקווי תאים HEK293 המבטאים ביציבות את KCC2b (HEKrnKCC2b)18 באמצעות טכניקת הכתם המערבי. פרטים מקיפים על התוצאות המייצגות נדונים ב- Zhang et al.15. בדומה ל-…

Discussion

שיטות רבות שימשו למדידת הפעילות של SLC12 של CCCs המתבטאים בתאי העצב, כולל KCC2. רבות מהטכניקות הללו הוכיחו את עצמן כמשפרות את הידע המדעי על ניתוח הרלוונטיות התפקודית של מובילים אלה ודפוסי המבנה-תפקוד שלהם במוטציות שונות הקשורות למחלות. באופן קריטי, ישנם יתרונות ואזהרות לשיטות השונות^21</…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions