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생화학

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/64179
, , ,
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences,University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

Abstract

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며, 뉴런에서만 발견되며 Cl– 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제에 필수적입니다. KCC2의 적절한 조절 실패는 해롭고 간질을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. KCC2의 규제와 관련된 메커니즘을 이해하는 것과 관련하여 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에서 프로토콜은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 키나아제 조절 부위(Thr906 및 Thr1007)에서 KCC2 인산화를 조사하는 방법을 강조합니다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 이러한 추가 기술 중 몇 가지가이 원고에서 간략하게 논의 될 것입니다.

Introduction

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 뉴런에서만 발견되는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며 Cl– 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제 1,2,3,4에 필수적입니다. KCC2에 의한 4-6 mM에서의 낮은 뉴런 내 Cl- 농도 ([Cl–] i)의 유지는 뇌 및 척수에서 γ– 아미노 부티르산 (GABA) / 글리신 과분극 및 시냅스 억제를 촉진한다5. KCC2의 적절한 조절 실패는 간질4을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. 또한, 감소된 KCC2-매개 Cl– 압출 및 손상된 과분극 GABAA 및/또는 글리신 수용체 매개 전류는 간질, 신경병증성 통증 및 경직과 관련이 있습니다6,7. 뉴런 KCC2는 미성숙 뉴런에서 탈분극된 GABA 활성의 유지를 용이하게 하는 비-라이신(WNK)-STE20/SPS1 관련 프롤린/알라닌 풍부(SPAK)/산화 스트레스 반응성(OSR) 키나아제 신호 전달 복합체1에 의해 C-말단 세포 내 도메인 내의 주요 조절 잔기의 인산화를 통해 음성으로 조절됩니다. . WNK-SPAK/OSR1은 트레오닌 잔기 906 및 1007(Thr906/Thr1007)을 인산화하고, 이어서 KCC2의 mRNA 유전자 발현을 하향조절하여 결과적으로 생리적 기능을 저하시킨다8,10. 그러나 더 중요한 것은 WNK-SPAK/OSR1 키나아제 복합체가 KCC2 발현 1,2,4,11,12를 인산화 및 억제하는 것으로 알려져 있으며, Thr906/Thr1007을 인산화하는 키나아제 복합체 신호전달 경로의 억제가 KCC2 mRNA 유전자13,14,15의 발현 증가와 관련이 있다는 것은 이미 사실입니다. . 단백질 인산화를 통한 신경 KCC2 및 Na+-K+-2Cl– 공수송체 1(NKCC1) 발현의 조절은 수반 작용하고 반대 패턴 1,4,16으로 작용한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

KCC2의 규제와 관련된 메커니즘에 대한 이해와 관련하여 일관되고 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에 제시된 프로토콜은 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서 공수송체의 인산화를 조사함으로써 뉴런 K+-Cl– 공동 수송체 KCC2의 기능과 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다.

웨스턴 블롯은 조직 또는 세포의 샘플에서 관심있는 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 방법입니다. 이 방법은 먼저 전기 영동을 통해 단백질을 크기별로 분리합니다. 그런 다음 단백질은 특정 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하기 전에 고체 지지체(일반적으로 막)로 전기영동적으로 전달됩니다. 항체는 비색, 화학발광 또는 형광 방법을 사용하여 검출되는 상이한 태그 또는 형광단-접합된 항체에 접합된다. 이를 통해 단백질 혼합물에서 특정 표적 단백질을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 KCC1 의 인특이적 부위를 특성화하는 데 사용되었으며 KCC3 Thr991/Thr1048 인산화17을 억제하는 키나아제 억제제를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 세포/조직 용해물에서 전체 및 인산화된 KCC2를 특이적으로 검출할 수 있습니다. 원칙적으로이 기술에 의한 단백질 접합 항체의 검출은 생리적 조절과 관련된 분자 메커니즘을 밝히는 KCC2의 인 부위에서의 협력 활동에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이되므로 매우 중요합니다. 전체 단백질 발현의 정량 분석은 KCC2의 기능 및 활성을 대표한다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다.

Protocol

참고: 프로토콜은 관심 있는 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅 방법을 설명합니다. 1. 세포 배양 및 형질감염 세포 배양 절차 전에 비드 배스(37°C)에서 모든 시약을 가온한다. 10 % 태아 소 혈청, 2mM L- 글루타민 각각 1 %, 100x 비 필수 아미노산, 100mM 나트륨 피루 베이트 및 100 단위 / mL 페니실린-스트렙토 마이신이 보충 된 배양 배지 인 Dulbecco의 변형 …

Representative Results

여기서, 도 1에 제시된 대표적인 결과는 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 KCC2b(HEKrnKCC2b)18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서 KCC2 및 NKCC1의 WNK-SPAK/OSR1 매개 인산화에 대한 스타우로스포린과 NEM의 영향을 조사하였다. 대표적인 결과에 대한 포괄적인 세부 사항은 Zhang et al.15에서 논의됩니다. NEM과 유사하게, 스타우로스포?…

Discussion

KCC2를 포함하는 뉴런에서 발현되는 CCC의 SLC12의 활성을 측정하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 이러한 기술 중 다수는 다양한 질병 관련 돌연변이에서 이러한 수송체의 기능적 관련성과 구조-기능 패턴 분석에 대한 과학적 지식을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 비판적으로, 다양한 방법(21)에 대한 장점과 주의사항이 있다. 그러나 위에서 설명한 프로토콜은 KCC2의 기능…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 영국 왕립 학회 (보조금 번호 IEC \ NSFC \ 201094) 및 Commonwealth Ph.D. 장학금.

Materials

40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions
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References

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