Method Article

관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성

DOI:

10.3791/64186

⸱

January 27th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh Swanson School of Engineering, 3Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University, 5Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, University of North Texas Health Science Center, 6Department of Bioengineering, Stanford University, 7McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 8The Chinese University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 무릎 관절의 연골, 뼈, 지방 패드 및 활막을 재현하는 데 사용되는 인간 중간엽 줄기 세포에서 4가지 유형의 조직을 생성하는 자세한 방법을 제공합니다. 이 4 개의 조직은 맞춤형 생물 반응기에 통합되고 미세 유체를 통해 연결되어 무릎 관절 온 칩을 생성합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골관절염(OA)과 같은 쇠약하게 만드는 관절 질환의 높은 유병률은 높은 사회경제적 부담을 줍니다. 현재 관절 질환을 표적으로 하는 사용 가능한 약물은 대부분 완화제입니다. 효과적인 질병 수정 OA 약물(DMOAD)에 대한 충족되지 않은 요구는 주로 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 DMOAD를 테스트하기 위한 적절한 모델의 부재로 인해 발생했습니다. 여기에서 우리는 인간 중간엽 줄기 세포(MSC)에서 유래된 지방, 섬유 및 골연골 조직 구성 요소를 포함하는 소형 활액 관절 모방 미세생리학적 시스템(miniJoint)의 확립을 설명합니다. 3차원(3D) 미세조직을 얻기 위해, 중간엽 줄기세포를 분화 전 또는 분화 후에 광가교결합성 메타크릴레이트화 젤라틴에 캡슐화하였다. 그런 다음 세포가 함유된 조직 구조를 3D 프린팅된 바이오리액터에 통합하여 miniJoint를 형성했습니다. 각각의 조직 표현형을 유지하기 위해 골형성, 섬유형성 및 지방형성 매체의 분리된 흐름을 도입했습니다. 일반적으로 공유되는 흐름은 연골, 활막 및 지방 조직을 통해 관류되어 조직 누화를 가능하게 했습니다. 이 흐름 패턴은 기계론적 연구를 위한 하나 이상의 조직 구성 요소에서 섭동의 유도를 허용합니다. 또한, 잠재적인 DMOAD는 모든 배지 스트림을 통한 "전신 투여" 또는 공유된 "활액" 시뮬레이션 흐름에만 약물을 추가하여 "관절 내 투여"를 통해 테스트할 수 있습니다. 따라서 miniJoint는 질병 메커니즘을 효율적으로 연구하고 개인화된 의학에서 약물을 테스트하기 위한 다목적 체외 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골관절염(OA)과 같은 관절 질환은 매우 만연하고 쇠약하게 하며 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 미국에서만 OA는 2,700만 명의 환자에게 영향을 미치며 60세 이상 성인의 12.1%에서 발생하는것으로 추정됩니다. 안타깝게도 현재 관절 질환 관리에 사용되는 대부분의 약물은 완화 약물이며 효과적인 질병 수정 OA 약물(DMOAD)은 사용할 수 없습니다3. 이러한 충족되지 않은 의학적 요구는 주로 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적인 DMOAD를 개발하기 위한 효과적인 모델의 부재에서 비롯됩니다. 종래의 2차원(2D) 세포 배양은 관절 조직의 3차원 특성을 반영하지 않으며, 조직 외식편의 배양은 종종 상당한 세포 사멸에 의해 방해를 받으며, 일반적으로 동적 조직 상호 연결을 복제하지 못한다4. 또한, 유전적 및 해부학적 차이는 동물모델의 생리학적 관련성을 현저히 감소시킨다4.

OoC(Organs-on-Chip) 또는 미세생리학적 시스템은 공학, 생물학 및 의학의 인터페이스에서 유망한 연구 분야입니다. 이러한 in vitr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 프로토콜은 피츠버그 대학교와 피츠버그 대학교의 인간 연구 윤리 위원회의 윤리 지침을 따릅니다. 이 연구에 사용된 재료에 대한 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 3D 프린팅 바이오리액터 제조

  1. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 챔버, 삽입물 및 뚜껑을 포함하는 osteochondral(그림 2A) 및 miniJoint 생물반응기(그림 2B)를 설계합니다. 각 부품에 대한 치수 정보는 그림 S1에 나와 있습니다.
  2. 디자인을 3D 프린터로 전송하고 포토폴리머 잉크로 인쇄합니다.
  3. 3D 프린팅 부품(그림 2C-F)을 95% 에탄올 15mL로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 손전등 중합 장치에서 200초 동안 인쇄된 조각을 완전히 가교합니다.
  4. 인서트와 덮개에 O-링을 추가하고(그림 2C, D) 부품이 맞는지 테스트합니다(그림 2G

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miniJoint에서 28일 동안 배양한 후 표현형을 분석하기 위해 miniJoint의 모든 조직을 수집했습니다(그림 4A). 이것은 이전 간행물7에 자세히 설명되어 있습니다.

RT-qPCR의 이용, 면역염색 및 조직학적 염색을 통해 개별 미세조직에 대해 조직 특이적 표현형이 잘 유지됨을 확인하였다(도 4). 예를 들어, OC 미세조직(OC-O)의 골 성분은 다른 조직 성분이 아닌 높은 수준의 오스테오칼신(OCN)을 발현했습니다. 대조적으로, 골연골 조직(OC-C)의 연골 부분에서는 콜라겐 II형(COL2) 및 아그레칸(ACAN)이 다른 조직보다 유의하게 높은 수준으로 발현되었습니다(그림 4B). 두 가지 대표적인 지방 생성 유전자.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 뼈, 연골, 지방 조직 및 활막과 같은 조직이 중간엽 줄기세포에서 형성되고 맞춤형 바이오리액터 내에서 공동 배양되는 무릎 관절 칩 시스템을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 플러그 앤 플레이 기능을 갖춘 이 다중 성분 인간 세포 유래 시스템은 관절 질환의 발병기전을 연구하고 약물을 개발하기 위한 새로운 도구입니다.

서로 다른 조직이 특정 배양 배지를 선호한다는 점을 감안할 때 각 조직에 대해 각각의 배지를 제공하고 흐름 간의 자유 배지 교환을 방지하는 것이 중요합니다. 특히, 이상성 골 연골 조직이 생성되는 동안 나이브 중간엽 줄기 세포의 운명은 노출되는 매질에 의해 결정됩니다. 현재 설계에서는 젤라틴 기반 하이드로겔을 스캐폴드로 사용하여 세포 성장을 위한 템플릿을 제공하고 조직과 삽입물 벽 사이의 잠재적인 틈을 밀봉합니다. 그러므로, 삽입물 내에서 겔을 in situ photocrosslink하는 것이 중요합니다. 또한, BMP7 및 TGFβ3.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 주로 국립 보건원(UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090)의 자금 지원을 받았습니다. 또한 인체 조직 샘플을 제공한 Paul Manner(워싱턴 대학교) 박사와 중간엽 줄기세포를 분리하고 세포 풀을 만드는 데 도움을 준 Jian Tan 박사에게 감사드립니다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-이소부틸-1-메틸크산틴시그마 -AldrichI17018-1G
6웰 비조직 배양 플레이트Corning Falcon® 플레이트351146
24 웰 비조직 배양 플레이트Corning Falcon® 플레이트351147
30 mL 주사기BD 주사기 Luer Lock Cascade Health302832
Alcian blue stainEK Industries11981% w/v, pH 1.0
Advanced DMEMGibco12491-015
α MEMGibco12571-063
항생제-항진균제Gibco15240-062
생검 펀치Integra Miltex12-460-407
BODIPY® 형광단분자 프로브
뼈 형태 생성 단백질 7 (BMP7)Peprotech
곡선 집게Fisher 브랜드16100110
DMEMGibco11995-065둘베코 s Modified Eagle Medium
DexmethasomeSigma -Aldrich02-05-2002
EnvisionTecRES-01-4022
Fetal bovine serumGemini-Bio Products900-208
GlutaMAXGibco3505-061
소 피부의 젤라Hyclone1003372809
Hank’ s 균형 잡힌 소금 용액시그마 -AldrichSH30588.02
인도메타신시그마 -AldrichI7378-56
인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 (ITS)Gibco51500-056
인터루킨 1βPeprotech200-01B
Leur-loc 커넥터Cole-Parmer Instruments45508-50
L-prolineSigma -Aldrich115388-93-7
β-glycerophosphateSigma -Aldrich1003129352
Medium bagsKiYATECFC045
메타크릴 무수물Sigma -Aldrich102378580
인산염 완충 식염수코닝21-040-CM
뾰족한 집게Fisher 브랜드12000122
실리콘 몰드McMaster-CarrRC00114P
실리콘 O-링McMaster-CarrZMCCs1X51mm x 5mm
SolidWorksDassault Systè mes SE, Vé lizy-Villacoublay, France
Surgical BladesIntegra Miltex4-122
주사기 펌프Lagato210P, KD ScientificZ56963110 주사기 랙
T-182 조직 배양 플라스크Fisher BrandFB012939
조직 배양 접시 150mmFisher BrandFB012925
Transforming Growth Factor Beta (TGF-& Beta; 3)Peprotech100-36E
TrypsinGibco25200-056
UV 손전등KBSKB70109395 nm
Vida 데스크탑 3D 프린터EnvisionTec
비타민 D3시그마 -Aldrich32222-06-31,25-dihydroxyvitamin D3
틴

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
  2. Lawrence, R. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Knee Joint ChipJoint Disease ModelingOsteoarthritis DrugsMicrophysiological SystemMesenchymal Stem Cells3D BioreactorCartilage DegenerationSynovial TissueDrug Testing PlatformTissue Crosstalk

Related Articles