Vurdering av termisk skade fra robotboret kraniotomi for kranialvinduskirurgi hos mus

Summary

Kraniale vinduer har blitt en allestedsnærværende implementert kirurgisk teknikk for å tillate intravital avbildning i transgene mus. Denne protokollen beskriver bruken av en kirurgisk robot som utfører halvautomatisk beinboring av kraniale vinduer og kan bidra til å redusere variasjonen mellom kirurg og kirurg og delvis redusere termisk blod-hjernebarriereskade.

Abstract

Kranial vinduskirurgi muliggjør avbildning av hjernevev i levende mus ved bruk av multifoton eller andre intravitale bildebehandlingsteknikker. Men når du utfører kraniotomi for hånd, er det ofte termisk skade på hjernevev, som er iboende variabel kirurgi til kirurgi og kan være avhengig av individuell kirurgteknikk. Implementering av en kirurgisk robot kan standardisere kirurgi og føre til en reduksjon i termisk skade forbundet med kirurgi. I denne studien ble tre metoder for robotboring testet for å evaluere termisk skade: horisontal, punkt-for-punkt og pulserende punkt-for-punkt. Horisontal boring benytter et kontinuerlig boreskjema, mens punkt-for-punkt borer flere hull som omfatter kranialvinduet. Pulsert punkt-for-punkt legger til et “2 s på, 2 s av” boreskjema for å tillate avkjøling mellom boring. Fluorescerende avbildning av Evans Blue (EB) fargestoff injisert intravenøst måler skade på hjernevev, mens et termoelement plassert under borestedet måler termisk skade. Termoelementresultater indikerer en signifikant reduksjon i temperaturendring i gruppen pulserende punkt-for-punkt (6,90 °C ± 1,35 °C) sammenlignet med gruppen horisontal (16,66 °C ± 2,08 °C) og punkt-for-punkt (18,69 °C ± 1,75 °C). Tilsvarende viste den pulserende punkt-for-punkt-gruppen også signifikant mindre EB-tilstedeværelse etter kranial vindusboring sammenlignet med den horisontale metoden, noe som indikerer mindre skade på blodkar i hjernen. Dermed ser en pulserende punkt-for-punkt-boremetode ut til å være den optimale ordningen for å redusere termisk skade. En robotdrill er et nyttig verktøy for å minimere trening, variasjon og redusere termisk skade. Med den økende bruken av multifotonavbildning på tvers av forskningslaboratorier, er det viktig å forbedre strengheten og reproduserbarheten av resultatene. Metodene som tas opp her, vil bidra til å informere andre om hvordan man bedre kan bruke disse kirurgiske robotene for å fremme feltet ytterligere.

Introduction

Kranialvinduer har blitt allestedsnærværende brukt innen nevrovitenskap, nevralteknikk og biologi for å muliggjøre direkte visualisering og avbildning av cortex hos levende dyr 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftige kombinasjonen av transgene mus og multifotonavbildning har gitt ekstremt verdifull innsikt i kretsaktivitet og annen biologisk innsikt i in vivo-hjernen 12,13,14,15,16,17,18. Miniatyrmikroskoper montert på hodeskallen har ytterligere utvidet disse mulighetene for å muliggjøre opptak i våkne, fritt bevegelige dyr¹⁹. Prosessen med å lage et kranialvindu krever kraftboring for å tynne eller helt fjerne kranialbenet for å produsere store nok kraniotomier for å sikre et gjennomsiktig stykke glass over cortex²⁰. Polydimetylsiloksan (PDMS) og andre polymerer har også blitt testet som kraniale vindusmaterialer ^9,21. Til syvende og sist er det ideelle kranialvinduet et som ikke endrer eller forstyrrer normal endogen aktivitet under. Imidlertid er det allment akseptert at kranialvinduboring forverrer underliggende vev, noe som fører til skade på hjernen, forstyrrelse av miljøet og påvirker meninges til det punktet å okkludere multifoton bildedybde²². Den resulterende nevroinflammasjonen har et bredt spekter av effekter som spenner fra permeabilitet av blod-hjernebarrieren (BBB), til aktivering og rekruttering av gliaceller rundt implantatstedet²³. Derfor er karakterisering av sikrere og mer reproduserbare kraniale vindusboremetoder avgjørende for konsistent bildekvalitet og reduksjon av forstyrrende faktorer.

Mens det tas hensyn til å minimere traumer til det underliggende vevet, har boringen av beinet potensial til å forårsake både termiske og mekaniske forstyrrelser i hjernen^24,25. Mekanisk traume fra utilsiktet borepenetrasjon i dura kan ytterligere indusere varierende grad av kortikal skade²⁴. I en studie av Shoffstall et al.25 resulterte varmen fra beinboring i økt BBB-permeabilitet, som indikert ved tilstedeværelsen av Evans Blue (EB) fargestoff i hjerneparenkymet ²⁵. EB-fargestoff, injisert intravenøst, binder seg til sirkulerende albumin i blodet og krysser derfor normalt ikke en sunn BBB i nevneverdige konsentrasjoner. Som et resultat blir EB-fargestoff ofte brukt som en sensitiv markør for BBB-permeabilitet^26,27. Selv om studien deres ikke direkte målte virkningen av BBB-permeabiliteten på påfølgende biologiske følger som ble studert, har tidligere studier korrelert BBB-permeabilitet til økt nevroinflammatorisk respons på kronisk implanterte mikroelektroder og endringer i motorisk funksjon²⁸.

Avhengig av målene for studien, kan størrelsen på termisk og mekanisk skade bidra til en kilde til eksperimentell feil, som negativt påvirker studiens strenghet og reproduserbarhet. Det finnes dusinvis av siterte metoder for å produsere kraniale vinduer, hver med forskjellig boreutstyr, hastigheter, teknikker og brukere 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterte at den observerte variasjonen i oppvarmingsresultatene ble tilskrevet variabilitet i borets påførte kraft, matehastighet og påføringsvinkel, blant andre aspekter som ikke kan kontrolleres for ved boring for hånd ²⁵. Det er en tro på at automatiserte boresystemer og annet stereotaktisk utstyr kan forbedre reproduserbarhet og utfallskonsistens, men publiserte metodestudier har ikke grundig evaluert temperatur eller BBB-permeabilitet som et av resultatene. Derfor er det behov for mer reproduserbare og konsekvent anvendte metoder for å produsere kraniale vinduer, samt metoder som brukes nøye for å vurdere virkningen av kranialvindusboring på underliggende nevralvev.

Fokus for denne studien er å bestemme og utvikle konsistente og sikre boremetoder for kraniale vinduer. Størrelsen på kraniotomi for kranialvinduinstallasjon er betydelig større enn standard kraniotomier for hjerneimplanterte mikroelektroder. Slike kraniotomier kan ikke kompletteres med et enkelt burrhull ved bruk av standardutstyr, og introduserer dermed mer variasjon i teknikken mellom kirurger når de utføres for hånd²⁰. Kirurgiske boreroboter har blitt introdusert til feltet, men har ikke blitt utbredt ^1,6,29. Automatisering av boring gir kontroll over variabler som bidrar til observert variasjon fra forsøk til forsøk, noe som tyder på at bruk av utstyret kan redusere inter- og intrakirurgeffekter. Dette er av spesiell interesse gitt den ekstra vanskeligheten med den større kraniotomien som trengs for kranialvindusplassering. Mens man kan anta at det er klare fordeler med kontrollen som automatiserer boringen gir, har det vært lite vurdering av implementeringen av dette utstyret. Selv om synlige lesjoner ikke er observert⁵, er man ønskelig med høyere sensitivitetstest med EB.

Her måles BBB-permeabilitet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kirurgisk borerobot med tilhørende programvare, som muliggjør programmering av stereotaktiske koordinater, kraniotomiplanlegging/kartlegging og et utvalg av borestiler (“punkt-for-punkt” vs “horisontal”), med henvisning til borekronens rutede bane. I utgangspunktet bores åtte “frø” -punkter (figur 1A), som beskriver kranialvinduet. Herfra kuttes mellomrommet mellom frøene ut ved hjelp av enten “punkt-for-punkt” eller “horisontal” boremetode. “Punkt-for-punkt” utfører vertikale pilothullkutt (ligner på en CNC-borepresse), mens “horisontal” utfører horisontale kutt langs omkretsen av kranialvinduet som skisserer hullet (ligner på en CNC-ruter). Resultatet for begge metodene er et stykke hodeskalle som kan fjernes for å avsløre kranialvinduet. For å isolere skader fra boring, fjernes ikke kranialvinduet fysisk, for å unngå ytterligere skade. En kombinasjon av EB-fargestoff kombinert med fluorescerende avbildning brukes til å måle BBB-permeabilitet etter å ha utført kraniotomier hos mus, og et innsatt termoelement brukes til å måle temperaturen på hjerneoverflaten direkte under boring (figur 1B, C). Tidligere observasjoner indikerte at pulserende boring på/av med 2 s intervaller var tilstrekkelig til å redusere borevarme²⁵, og er derfor innarbeidet i den eksperimentelle tilnærmingen for operasjonsroboten.

Hensikten med det presenterte arbeidet er å demonstrere metoder for å vurdere termisk skade fra kraniotomiboring. Mens metodene presenteres i sammenheng med automatisert boring, kan slike metoder også brukes på manuelle boreordninger. Disse metodene kan brukes til å validere bruken av utstyr og/eller boreskjemaer før de tas i bruk som standardprosedyre.

Figur 1: Skjematisk eksperimentell pipeline. Skjematisk demonstrering av prosessen dyr gjennomgikk for EB-kvantifisering etter kranialvindusprosedyre. (A) Skjematisk oppsett av musen med stereotaksisk ramme og kirurgisk robotbor. Et eksempel på kranievindu er vist over den motoriske hjernebarken med frøpunkter (grønn) og kantpunkter (blå). (B) Perfusjonsoppsettet inkluderer injeksjon av 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i hele dyret for å fjerne blod, etterfulgt av ekstraksjon av hjernen. (C) Hjernen blir deretter satt inn i EB fluorescerende bildesystemkammer for å utføre fluorescerende avbildning på Evans Blue-fargestoffet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle prosedyrer og dyrepleiepraksis ble gjennomgått, godkjent av og utført i samsvar med Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Oppsett av kirurgisk robotmaskinvare Før operasjonen, følg den kirurgiske roboten (se Materialfortegnelse) håndbok og veiledning for å sette opp maskinvare og programvare. Utfør rammekalibrering som beskrevet i håndboken. Hvis boret eller r…

Representative Results

Termisk evalueringPotensialet for termisk skade ble evaluert ved å måle temperaturendringen fra baseline på grunn av boring ved hjelp av horisontale (figur 2A), punkt-for-punkt (figur 2B) og pulserende punkt-for-punkt (figur 2C) metoder. Figur 2D viser det eksperimentelle oppsettet for innhenting av termiske data. En prøvestørrelse på N = 4 kraniale vinduer ble brukt til termi…

Discussion

Bruk av EB-fargestoff og avbildning er enkelt, raskt og nyttig for å evaluere vaskulær skade i hjernen for nye metoder og teknikker. Enten du bruker en kirurgisk robot eller bekrefter metoder som for tiden gjøres i laboratoriet, er det viktig å validere kirurgiske metoder for å isolere effekten av eksperimentelle behandlinger vs. kirurgisk påvirkning og forbedre dyrevelferden. Et termoelementoppsett er også nyttig for å evaluere boremetoder for å sikre at det ikke oppstår oppvarming. Temperaturøkninger på gru…

Materials

1x Phosphate Buffered Saline Type: Reagent	VWR	MRGF-6235	For Evans Blue dilution
Aura Software Type: Tool	Spectral Instruments Imaging		Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems
Buprenorphine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) Type: Tool	Stoelting	58640-1
Carprofen Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Cefazolin Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Evans Blue Dye Type: Reagent	Millipore Sigma	E2129	Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline
Isoflurane Type: Drug	Sourced from Animal Facility
IVIS Lumina II Type: Tool	Perkin Elmer	CLS136334	IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market
Jenco Linearizing Thermometer Type: Tool	Jenco	765JF	For Thermocouple setup
Ketamine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
LivingImage Type: Tool	Perkin Elmer		Software for IVIS Lumina III
Marcaine Type: Drug	Sourced from Animal Facility
Neurostar Software Type: Tool	Stoelting		Comes with surgical robot purchase
Physiosuite with MouseSTAT® Pulse Oximeter & Heart Rate Monitor Type: Tool	Kent Scientific	PS-03	Used to monitor vitals
PrismPlus mice Type: Animal	Jackson Labortory	031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old	Animals used for the study
Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Type: Tool	Stoelting	58640	Main robotic drill with stereotaxic frame
Thermocouple Type: Tool	TC Direct	206-557	For Thermocouple setup
USB-6008 Multifunction I/O DAQ Type: Tool	National Instruments	USB-6008	For Thermocouple setup
Xylazine Type: Drug	Sourced from Animal Facility