Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie
Summary
Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.
Abstract
Het begrijpen van de metabole gevolgen van microbiële interacties die optreden tijdens infectie vormt een unieke uitdaging op het gebied van biomedische beeldvorming. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging massaspectrometrie vertegenwoordigt een labelvrije, in situ beeldvormingsmodaliteit die in staat is om ruimtelijke kaarten te genereren voor een breed scala aan metabolieten. Hoewel dun gesneden weefselmonsters nu routinematig worden geanalyseerd via deze technologie, blijven beeldvormende massaspectrometrie-analyses van niet-traditionele substraten, zoals bacteriekolonies die vaak op agar worden gekweekt in microbiologisch onderzoek, een uitdaging vanwege het hoge watergehalte en de ongelijke topografie van deze monsters. Dit artikel demonstreert een monstervoorbereidingsworkflow om massaspectrometrieanalyses van deze monstertypen mogelijk te maken. Dit proces wordt geïllustreerd met behulp van bacteriële co-cultuur macrokolonies van twee gastro-intestinale pathogenen: Clostridioides difficile en Enterococcus faecalis. Het bestuderen van microbiële interacties in deze goed gedefinieerde agar-omgeving blijkt ook een aanvulling te zijn op weefselstudies die gericht zijn op het begrijpen van microbiële metabole samenwerking tussen deze twee pathogene organismen in muismodellen van infectie. Imaging massaspectrometrie analyses van de aminozuur metabolieten arginine en ornithine worden gepresenteerd als representatieve gegevens. Deze methode is breed toepasbaar op andere analyten, microbiële pathogenen of ziekten, en weefseltypen waarbij een ruimtelijke maat van cellulaire of weefselbiochemie gewenst is.
Introduction
Het menselijk microbioom is een zeer dynamisch ecosysteem met moleculaire interacties van bacteriën, virussen, archaea en andere microbiële eukaryoten. Hoewel microbiële relaties de afgelopen jaren intensief zijn bestudeerd, moet er nog veel worden begrepen over microbiële processen op chemisch niveau 1,2. Dit is deels te wijten aan de onbeschikbaarheid van tools die in staat zijn om complexe microbiële omgevingen nauwkeurig te meten. Vooruitgang op het gebied van imaging massaspectrometrie (IMS) in het afgelopen decennium heeft in situ en labelvrije ruimtelijke mapping van vele metabolieten, lipiden en eiwitten in biologische substraten mogelijk gemaakt 3,4. Matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) is naar voren gekomen als de meest voorkomende ionisatietechniek die wordt gebruikt bij het afbeelden van massaspectrometrie, waarbij een UV-laser wordt gebruikt om materiaal van het oppervlak van een dunne weefselsectie af te breken voor meting door massaspectrometrie4. Dit proces wordt vergemakkelijkt door de toepassing van een chemische matrix die homogeen op het oppervlak van het monster wordt aangebracht, waardoor opeenvolgende metingen in een rasterpatroon over het monsteroppervlak kunnen worden uitgevoerd. Heatmaps van analytionintensiteiten worden vervolgens gegenereerd na gegevensverzameling. Recente ontwikkelingen in ionisatiebronnen en bemonsteringstechnieken hebben de analyse mogelijk gemaakt van niet-traditionele substraten zoals bacteriële5 en zoogdier 6,7,8 cellulaire monsters gekweekt op voedingsagar. De moleculaire ruimtelijke informatie van IMS kan een uniek inzicht geven in de biochemische communicatie van microbe-microbe en gastheer-microbe interacties tijdens infectie 9,10,11,12,13,14.
Bij Clostridioides difficile-infectie (CDI) wordt C. difficile blootgesteld aan een snel veranderende microbiële omgeving in het maagdarmkanaal, waar polymicrobiële interacties waarschijnlijk van invloed zijn op de infectieresultaten15,16. Verrassend genoeg is er weinig bekend over de moleculaire mechanismen van interacties tussen C. difficile en residente microbiota tijdens infectie. Enterokokken zijn bijvoorbeeld een klasse van opportunistische commensale pathogenen in het darmmicrobioom en zijn geassocieerd met een verhoogde gevoeligheid voor en ernst van CDI17,18,19,20. Er is echter weinig bekend over de moleculaire mechanismen van de interacties tussen deze pathogenen. Om de communicatie van kleine moleculen tussen deze leden van het darmmicrobioom te visualiseren, werden bacteriële macrokolonies hierin op agar gekweekt om microbe-microbe-interacties en bacteriële biofilmvorming in een gecontroleerde omgeving te simuleren. Het verkrijgen van representatieve metabole verdelingen bij MALDI-beeldvormingsmassaspectrometrie-analyse van bacteriële cultuurmonsters is echter een uitdaging vanwege het hoge watergehalte en de ongelijke oppervlaktetopografie van deze monsters. Dit wordt grotendeels veroorzaakt door de zeer hydrofiele aard van agar en de niet-uniforme agar-oppervlakterespons tijdens vochtverwijdering.
Het hoge watergehalte van agar kan het ook een uitdaging maken om een homogene MALDI-matrixcoating te bereiken en kan de daaropvolgende MALDI-analyse in vacuo21 verstoren. Veel MALDI-bronnen werken bijvoorbeeld bij een druk van 0,1-10 Torr, wat een voldoende vacuüm is om vocht uit de agar te verwijderen en vervorming van het monster kan veroorzaken. Deze morfologische veranderingen in de agar veroorzaakt door de vacuümomgeving veroorzaken borrelen en scheuren in het gedroogde agarmateriaal. Deze artefacten verminderen de hechting van de agar aan de schuif en kunnen demontage of schilfering van het monster in het instrumentvacuümsysteem veroorzaken. De dikte van de agarmonsters kan tot 5 mm van de schuif zijn, wat onvoldoende speling van ionoptiek in het instrument kan veroorzaken, waardoor verontreiniging en / of schade aan de ionoptiek van het instrument kan ontstaan. Deze cumulatieve effecten kunnen resulteren in vermindering van het ionensignaal dat de oppervlaktetopografie reflecteert, in plaats van de onderliggende microbiële biochemische interacties. Agarmonsters moeten homogeen worden gedroogd en sterk aan een microscoopglaasje worden gehecht voordat ze in vacuo worden geanalyseerd.
Dit artikel demonstreert een monstervoorbereidingsworkflow voor het gecontroleerd drogen van bacteriecultuur macrokolonies gekweekt op agar media. Dit meerstaps, langzamere droogproces (ten opzichte van de eerder gemelde) zorgt ervoor dat de agar gelijkmatig zal uitdrogen, terwijl de effecten van borrelen of kraken van agarmonsters die op microscoopglaasjes zijn gemonteerd, worden geminimaliseerd. Door deze geleidelijke droogmethode worden monsters sterk aan de microscoopplaat gehecht en zijn ze geschikt voor latere matrixtoepassing en MALDI-analyse. Dit wordt geïllustreerd met behulp van model bacteriële kolonies van C. difficile gekweekt op agar en murine weefselmodellen met CDI met en zonder de aanwezigheid van commensale en opportunistische pathogenen, Enterococcus faecalis. MALDI imaging massaspectrometrie-analyses van zowel bacteriële als weefselmodellen maken het mogelijk om aminozuurmetabolietprofielen ruimtelijk in kaart te brengen, wat nieuw inzicht biedt in bio-energetisch microbieel metabolisme en communicatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens maldi imaging massaspectrometrie is het belangrijk om een vlak monsteroppervlak te hebben om te zorgen voor een consistente brandpuntsdiameter van de invallende MALDI-laser op het monstersubstraat. Afwijkingen in de monsterhoogte kunnen ertoe leiden dat de MALDI-laserstraal onscherp wordt, waardoor veranderingen in de diameter en intensiteit van de bundel ontstaan, wat de MALDI-ionisatie-efficiëntie kan beïnvloeden. Deze veranderingen in ionisatie-efficiëntie kunnen resulteren in verschillen in analytintensite…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) onder toekenning GM138660. J.T.S. werd ondersteund door de Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship van de Universiteit van Florida. J.P.Z. werd ondersteund door NIH-subsidies K22AI7220 (NIAID) en R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. werd ondersteund door de Cell and Molecular Biology Training Grant aan de Universiteit van Pennsylvania (T32GM07229).
Materials
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , (2014).
