طريقة بصرية حساسة للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين مع بروتوكول معدل يستخدم لترسيب كبريتيد البزموت (BS). المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها سهلة التقييم ولا تتطلب معدات متخصصة.
Abstract
كبريتيد الهيدروجين (H2S) هو غاز سام تنتجه البكتيريا في التحلل البروتيني للأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت والتي تلعب دورا مهما في صحة الإنسان. يعد اختبار إنتاج H2S أحد اختبارات تحديد الهوية الكيميائية الحيوية البكتيرية المهمة. الطرق التقليدية ليست فقط مملة وتستغرق وقتا طويلا ولكنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة وحساسة للكشف عن H2S في البكتيريا. هذه الطريقة هي نسخة معدلة من ترسيب كبريتيد البزموت (BS) الذي يستخدم 96 لوحة معايرة شفافة جيدا. تم دمج الثقافة البكتيرية مع محلول البزموت الذي يحتوي على L-cysteine وزراعته لمدة 20 دقيقة ، وفي النهاية لوحظ راسب أسود. كان حد الكشف البصري ل H 2 S0.2mM. بناء على تغير اللون المرئي ، يمكن تحقيق الكشف البسيط وعالي الإنتاجية والسريع للبكتيريا المنتجة ل H2S. باختصار ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد إنتاج H2S في البكتيريا.
Introduction
يمكن للبكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين استخدام الأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت لإنتاج كبريتيد الهيدروجين (H2S). يحدث إنتاج H2S عادة في بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae سالبة الجرام وأيضا في أعضاء Citrobacter spp. و Proteus spp. و Edwardsiella spp. و Shewanella spp.1. هذه البكتيريا لديها القدرة على تقليل الكبريتات إلى كبريتيد الهيدروجين (H2S) من أجل الحصول على الطاقة. وقد تورط كبريتيد الهيدروجين في تطوير مقاومة البكتيريا للأدوية. يحمي H 2 S البكتيريا من سمية أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وبالتالي يعادي التأثير المضاد للبكتيرياللمضادات الحيوية 2,3. H2S له أيضا تأثير فسيولوجي مهم في الحفاظ على الاتزان الداخلي. على المستويات فوق الفسيولوجية ، ثبت أن H2S سام للغاية للجسم. في جسم الإنسان ، يلعب H2S دورا آخر كجزيء إشارات غاز يشارك في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. يمكن ل H2S تنظيم الوظيفة الانقباضية للقلب ويلعب دورا فسيولوجيا مهما في استرخاء الأوعية الدموية ، وتثبيط إعادة تشكيل الأوعية الدموية ، وحماية عضلة القلب 4,5. يلعب H2S أيضا دورا مهما في تنظيم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي 6,7. لقد وجد أنه عند تعرضها للمضادات الحيوية المبيدة للجراثيم ، تنتج البكتيريا أنواع الأكسجين التفاعلية القاتلة (ROS) مما يؤدي إلى موت الخلايا8،9،10،11.
كاختبار كيميائي حيوي شائع في دورات المختبرات الميكروبيولوجية ، يعد اختبار كبريتيد الهيدروجين تجربة مهمة في تحديد البكتيريا ، وخاصة بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae. في الوقت الحاضر ، يتم إجراء اختبار كبريتيد الهيدروجين عادة على عدد كبير من الأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت ووسط أسيتات الرصاص الملقح بالبكتيريا المراد اختبارها. بعد فترة من الحضانة (2-3 أيام) ، يتم الحكم على النتائج من خلال ملاحظة ما إذا كان وسط الاستزراع أو شريط ورق أسيتات الرصاص أسود بسبب إنتاج أسيتات الرصاص11. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق التقليدية ليست مملة وتستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل إنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. تم إنشاء طريقة قائمة على البزموت للكشف عن H2S12,13. يمكن أن يتفاعل H2S مع البزموت ، مكونا هطول كبريتيد البزموت الأسود. من أجل إجراء إصلاح لهذا الاختبار الكيميائي الحيوي ، يجب إنشاء طريقة بسيطة وسريعة بدون آثار جانبية على نمو البكتيريا. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين التي تنمو في بيئة في المختبر باستخدام كبريتيد البزموت كركيزة في شكل لوحة عيار ميكرو 96 بئرا.
Protocol
Representative Results
Discussion
اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين هو أحد اختبارات النمط الظاهري التقليدية لتحديد وتمايز السلالات البكتيرية. يمكن للعديد من الأنواع البكتيرية إنتاج كبريتيد الهيدروجين في بيئتها الطبيعية ، مثل المياه المائية. تشمل هذه الأنواع البكتيرية السالمونيلا sp. ، Citrobacter sp. ، Proteus sp. ، Ps…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD) ومشروع أبحاث إصلاح التدريس بجامعة الصين الصيدلانية (2019XJYB18).
Materials
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
References
- Thompson, L. S. The group of hydrogen sulphide producing bacteria. Journal of Medical Research. 42 (184), 383-389 (1921).
- Ono, K., et al. Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria. ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).
- Mironov, A., et al. Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).
- Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167 (2015).
- Salloum, F. N. Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability. Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).
- Wallace, J. L., Wang, R. Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).
- Wu, D., et al. Role of hydrogen sulfide in ischemia-reperfusion injury. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 186908 (2015).
- Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O’Brien, P. J. Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity. Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).
- Shatalin, K., et al. Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance. Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).
- Frávega, J., et al. Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).
- Luhachack, L., Nudler, E. Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics. Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).
- Yoshida, A., et al. Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria. Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).
- Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro. Journal of Oral Microbiology. 7, 28166 (2015).
- Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas. Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).
- Barton, L. L., Fauque, G. D. Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria. Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).
- Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria. Science. 334 (6058), 986-990 (2011).
- Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water. Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).
- Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR. Journal of Microbiological Methods. 183, 106171 (2021).
