En känslig visuell metod för detektion av vätesulfidproducerande bakterier

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att detektera vätesulfidproducerande bakterier med ett modifierat protokoll som används för utfällning av vismutsulfid (BS). De viktigaste fördelarna med denna metod är att den är lätt att utvärdera och inte kräver specialutrustning.

Abstract

Vätesulfid (_H2S) är en giftig gas som produceras av bakterier vid proteolys av svavelhaltiga aminosyror och proteiner som spelar en viktig roll för människors hälsa. H₂S-produktionstestet är ett av de viktiga bakteriella biokemiska identifieringstesterna. De traditionella metoderna är inte bara tråkiga och tidskrävande utan också benägna att hämma bakterietillväxt på grund av den toxiska effekten av tungmetallsalter i svavelhaltigt medium, vilket ofta leder till negativa resultat. Här etablerade vi en enkel och känslig metod för att detektera_H2Si bakterier. Denna metod är en modifierad version av vismutsulfid (BS) utfällning som använder 96-väl transparenta mikrotiterplattor. Bakteriekulturen kombinerades med vismutlösning innehållande L-cystein och odlades i 20 minuter, i slutet av vilken en svart fällning observerades. Den visuella detektionsgränsen för H 2 S var_0,2mM. Baserat på den visuella färgförändringen kan den enkla, höga genomströmningen och snabba detektionen av_{H2S-producerande}bakterier uppnås. Sammanfattningsvis kan denna metod användas för att identifiera_{H2S-produktion}i bakterier.

Introduction

Vätesulfidproducerande bakterier kan utnyttja svavelhaltiga aminosyror och proteiner för att producera vätesulfid (_H2S). Produktionen av_H2Ssker vanligtvis i gramnegativa Enterobacteriaceae-familjebakterier och även hos medlemmar av Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. och Shewanella spp.1. Dessa bakterier har förmågan att reducera sulfat till vätesulfid (_H2S) för att erhålla energi. Vätesulfid har varit inblandad i utvecklingen av bakteriell läkemedelsresistens. _H2Sskyddar bakterier från toxiciteten hos reaktiva syreradikaler (ROS), vilket motverkar den antibakteriella effekten av antibiotika ^2,3. _H2Shar också en viktig fysiologisk effekt för att upprätthålla homeostas. Vid suprafysiologiska nivåer har_H2Svisat sig vara djupt giftigt för kroppen. I människokroppen har_H2Sen annan roll som en gassignalmolekyl som är involverad i en mängd olika fysiologiska och patologiska processer. _H2Skan reglera hjärtats systoliska funktion och spelar en viktig fysiologisk roll för att slappna av blodkärlen, hämma vaskulär ombyggnad och skydda hjärtmuskeln ^4,5. _H2Sspelar också en viktig roll i regleringen av nervsystemet och mag-tarmkanalen ^6,7. Det har visat sig att bakterier, när de utsätts för bakteriedödande antibiotika, producerar dödliga reaktiva syrearter (ROS) som leder till celldöd 8,9,10,11.

Som ett vanligt biokemiskt test i mikrobiologiska laboratoriekurser är vätesulfidtestet ett viktigt experiment vid identifiering av bakterier, särskilt bakterier av familjen Enterobacteriaceae. För närvarande utförs vätesulfidtestet vanligtvis på ett stort antal svavelhaltiga aminosyror och blyacetatmedium inokulerade med bakterierna som ska testas. Efter en inkubationsperiod (2-3 dagar) bedöms resultaten genom att observera om odlingsmediet eller blyacetatpappersremsan är svärtad på grund av blyacetatproduktion¹¹. Dessa traditionella metoder är emellertid inte bara tråkiga och tidskrävande utan också benägna att hämma bakterietillväxt på grund av den toxiska effekten av tungmetallsalter i svavelhaltigt medium, vilket ofta leder till negativa resultat. En vismutbaserad metod har fastställts för detektion av H2S^12,13. _H2Skan reagera med vismut och bilda utfällning av svart vismutsulfid. För att genomföra en reform för detta biokemiska test måste en enkel och snabb metod utan biverkningar på bakterietillväxt etableras. Här satte vi upp en enkel metod för detektion av vätesulfidproducerande bakterier odlade i en in vitro-miljö med vismutsulfid som substrat i ett 96-brunns mikrotiterplattformat.

Protocol

1. Bakteriestammar OBS: För detta experiment användes nio standardstammar, inklusive Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris och Klebsiella pneumoniae (tabell 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium…

Representative Results

Detektion av vätesulfidproducerande bakterierPrestanda för H2S-testet undersöktes med användning av rena kulturer av utvalda bakteriestammar, som anges i tabell 1. Resultaten indikerade att Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa och Proteus vuigaris kan produceraH2Smed svart BS-fällning, medan Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aero…

Discussion

Vätesulfidproduktionstestet är ett av de konventionella fenotypiska testerna för identifiering och differentiering av bakteriestammar. Många bakteriearter kan producera vätesulfid i sin naturliga miljö, såsom vattenvatten. Dessa bakteriearter inkluderar Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., vissa stammar av Klebsiella sp., Escherichia coli och vissa arter av anaerob Clostridia^15,16</s…

Materials

Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8