संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस वाले बच्चों से परिधीय रक्त नमूनों में प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी का पृथक्करण
Summary
हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (मोनोसाइट्स, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं) की परिभाषित प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक बीड्स और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग के संयोजन की एक विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि का उपयोग करके, चुंबकीय और फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को शुद्ध और विश्लेषण किया जा सकता है।
Abstract
संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (आईएम) एक तीव्र सिंड्रोम है जो ज्यादातर प्राथमिक एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी) संक्रमण से जुड़ा होता है। मुख्य नैदानिक लक्षणों में अनियमित बुखार, लिम्फैडेनोपैथी और परिधीय रक्त में लिम्फोसाइटों में काफी वृद्धि शामिल है। आईएम का रोगजनक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है; इसके लिए कोई प्रभावी उपचार विधि नहीं है, मुख्य रूप से रोगसूचक उपचार उपलब्ध हैं। ईबीवी इम्यूनोबायोलॉजी में मुख्य सवाल यह है कि संक्रमित व्यक्तियों का केवल एक छोटा सा उप-समूह गंभीर नैदानिक लक्षण क्यों दिखाता है और यहां तक कि ईबीवी से जुड़ी विकृतियों को विकसित करता है, जबकि अधिकांश व्यक्ति वायरस के साथ जीवन के लिए स्पर्शोन्मुख होते हैं।
बी कोशिकाएं पहले आईएम में शामिल होती हैं क्योंकि ईबीवी रिसेप्टर्स उनकी सतह पर प्रस्तुत किए जाते हैं। प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं साइटोटोक्सिक जन्मजात लिम्फोसाइट्स हैं जो ईबीवी-संक्रमित कोशिकाओं को मारने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सीडी 4 + टी कोशिकाओं का अनुपात कम हो जाता है जबकि सीडी 8 + टी कोशिकाओं का अनुपात तीव्र ईबीवी संक्रमण के दौरान नाटकीय रूप से फैलता है, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की दृढ़ता आईएम के आजीवन नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है। वे प्रतिरक्षा कोशिकाएं आईएम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, और उनके कार्यों को अलग से पहचानने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, मोनोसाइट्स को पहले सीडी 14 माइक्रोबीड्स, एक कॉलम और एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके आईएम व्यक्तियों के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग किया जाता है।
शेष पीबीएमसी को पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन (पेरसीपी)/साइनिन 5.5 एंटी-सीडी 3, एलोफीकोसायनिन (एपीसी)/साइनिन 7 एंटी-सीडी 4, फाइकोएरिथ्रिन (पीई) एंटी-सीडी 8, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) एंटी-सीडी 19, एपीसी एंटी-सीडी 56, और एपीसी एंटी-सीडी 16 एंटीबॉडी से दाग दिया जाता है। इसके अलावा, आईएम में उनके कार्यों और रोगजनक तंत्र का पता लगाने के लिए पांच उप-आबादी के ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था।
Introduction
एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी), एक γ-हर्पीसवायरस जिसे मानव हर्पीस वायरस टाइप 4 के रूप में भी जाना जाता है, मानव आबादी में सर्वव्यापी है और वयस्क आबादी के 90% से अधिक में आजीवन अव्यक्त संक्रमण स्थापित करताहै। अधिकांश ईबीवी प्राथमिक संक्रमण बचपन और किशोरावस्था के दौरान होता है, जिसमें संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (आईएम) 2 के साथ रोगियों का एक अंश प्रकट होता है, जिसमें विशिष्ट इम्यूनोपैथोलॉजी दिखाई देती है, जिसमें रक्त में सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ओरोफैरिंक्स3 में ईबीवी-संक्रमित बी कोशिकाओं का क्षणिक प्रसार शामिल है। आईएम का कोर्स 2-6 सप्ताह तक चल सकता है और अधिकांश रोगी अच्छी तरह से ठीक होजाते हैं। हालांकि, कुछ व्यक्ति उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ लगातार या आवर्तक आईएम जैसे लक्षण विकसित करते हैं, जिसे क्रोनिक सक्रिय ईबीवी संक्रमण (सीएईबीवी) 5 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसके अलावा, ईबीवी एक महत्वपूर्ण ऑन्कोजेनिक वायरस है, जो विभिन्न प्रकार की विकृतियों से निकटता से संबंधित है, जिसमें एपिथेलॉइड और लिम्फोइड दुर्भावनाएं जैसे कि नासोफैरेनजील कार्सिनोमा, बर्किट का लिम्फोमा, हॉजकिन लिंफोमा (एचएल), और टी / एनके सेल लिम्फोमा6 शामिल हैं। यद्यपि ईबीवी का अध्ययन 50 से अधिक वर्षों से किया गया है, इसके रोगजनन और तंत्र जिसके द्वारा यह लिम्फोसाइटों के प्रसार को प्रेरित करता है, पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है।
कई अध्ययनों ने ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण द्वारा ईबीवी संक्रमण के इम्यूनोपैथोलॉजी के लिए आणविक हस्ताक्षर की जांच की है। झोंग एट अल ने आईएम या सीएईबीवी वाले चीनी बच्चों से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के पूरे-ट्रांसस्क्रिप्टम प्रोफाइलिंग का विश्लेषण किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि सीडी 8 + टी सेल विस्तार मुख्य रूप से आईएम समूह7 में पाया गया था, यह सुझाव देते हुए कि सीडी 8 + टी कोशिकाएं आईएम में एक प्रमुख भूमिका निभा सकती हैं। इसी तरह, एक अन्य अध्ययन में ईबीवी-विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी और सीडी 19 + बी कोशिकाओं का कम अनुपात और प्राथमिक ईबीवी संक्रमण के कारण आईएम वाले रोगियों में सीडी 8 + टी कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत पायागया, जो ईबीवी पुनर्सक्रियन और अन्य एजेंटों दोनों के कारण आईएम के रोगियों में होता है। बी कोशिकाएं पहले आईएम में शामिल होती हैं क्योंकि ईबीवी रिसेप्टर्स उनकी सतह पर प्रस्तुत किए जाते हैं। अल तबा एट अल ने पाया कि बी कोशिकाओं को पॉलीक्लोनल रूप से सक्रिय किया गया था और आईएम 9 के दौरान प्लास्माब्लास्ट्स (सीडी 19 +, सीडी 27 + और सीडी 20 −, और सीडी 138 − कोशिकाओं) और प्लाज्मा कोशिकाओं (सीडी 19 +, सीडी 27 + और सीडी 20 −, और सीडी 138 +) में विभेदित कियागया था। इसके अलावा, झोंग एट अल ने पाया कि मोनोसाइट मार्कर सीडी 14 और सीडी 64 सीएईबीवी में अनियंत्रित थे, यह सुझाव देते हुए कि मोनोसाइट्स एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) और हाइपरएक्टिव फागोसाइटोसिस7 के माध्यम से सीएईबीवी की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। अल्का एट अल ने आईएम या एचएल के चार रोगियों से एमएसीएस क्रमबद्ध सीडी 56मंद सीडी 16 + एनके कोशिकाओं के प्रतिलेख की विशेषता बताई और पाया कि आईएम और एचएल दोनों से एनके कोशिकाओं ने जन्मजात प्रतिरक्षा और केमोकाइन सिग्नलिंग जीन को कम कर दिया था, जो एनके कोशिकाओं10 की हाइपोरिस्पॉन्सिवनेस के लिए जिम्मेदार हो सकता है। इसके अलावा, ग्रीनो एट अल ने आईएम वाले व्यक्तियों के 10 पीबीएमसी से क्रमबद्ध सीडी 8 + टी कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। उन्होंने बताया कि आईएम में सीडी 8 + टी कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा वायरस-विशिष्ट, सक्रिय, विभाजित और प्रभावकगतिविधियों को लागू करने के लिए प्रमुख था। टी सेल-मध्यस्थता, ईबीवी-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं और एनके सेल-मध्यस्थता, गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं प्राथमिक ईबीवी संक्रमण के दौरान आवश्यक भूमिका निभाती हैं। हालांकि, इन अध्ययनों ने केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विविध मिश्रण या लिम्फोसाइटों की केवल एक निश्चित उप-जनसंख्या के प्रतिलेख परिणामों की जांच की, जो एक ही रोग स्थिति में आईएम वाले बच्चों में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी की आणविक विशेषताओं और कार्यों की व्यापक तुलना के लिए पर्याप्त नहीं है।
यह पेपर एक विधि का वर्णन करता है जो पीबीएमसी (मोनोसाइट्स, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं) की परिभाषित प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक बीड्स और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) को जोड़ती है। इस विधि का उपयोग करके, चुंबकीय और फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को चुंबकीय विभाजक और एफएसीएस का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है या प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण के लिए शुद्ध कोशिकाओं से आरएनए निकाला जा सकता है। यह विधि आईएम वाले व्यक्तियों की बीमारी की समान अवस्थाओं में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लक्षण वर्णन और जीन अभिव्यक्ति को सक्षम करेगी, जो ईबीवी संक्रमण के इम्यूनोपैथोलॉजी की हमारी समझ का विस्तार करेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को क्रमबद्ध करने का एक कुशल तरीका दर्शाता है। इस अध्ययन में, आईएम, स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के रोगियों के शिरापरक रक्त के नमूनों …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82002130), बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (7222059) और चिकित्सा विज्ञान के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (2019-आई 2 एम-5-026) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
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