감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리
Summary
면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.
Abstract
전염성 단핵구증(IM)은 주로 원발성 엡스타인–바 바이러스(EBV) 감염과 관련된 급성 증후군입니다. 주요 임상 증상으로는 불규칙한 발열, 림프절 병증 및 말초 혈액의 림프구 증가가 있습니다. IM의 병원성 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 효과적인 치료 방법은 없으며 주로 증상 치료법을 사용할 수 있습니다. EBV 면역생물학의 주요 질문은 왜 감염된 개인의 소수만이 심각한 임상 증상을 보이고 심지어 EBV 관련 악성 종양이 발생하는 반면, 대부분의 개인은 바이러스에 감염된 평생 동안 무증상입니다.
B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. 자연 살해(NK) 세포는 EBV 감염 세포를 죽이는 데 중요한 세포독성 선천 림프구입니다. 급성 EBV 감염 동안 CD4+ T 세포의 비율은 감소하는 반면 CD8+ T 세포의 비율은 극적으로 확장되며, CD8+ T 세포의 지속성은 IM의 평생 제어에 중요합니다. 이러한 면역 세포는 IM에서 중요한 역할을 하며 그 기능은 별도로 식별해야 합니다. 이러한 목적을 위해, 단핵구는 먼저 CD14 마이크로비드, 컬럼 및 자기 분리기를 사용하여 IM 개체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된다.
나머지 PBMC는 페리디닌-클로로필 단백질 (PerCP)/시아닌 5.5 항-CD3, 알로피코시아닌 (APC)/시아닌 7 항-CD4, 피코에리트린 (PE) 항-CD8, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-CD19, APC 항-CD56 및 APC 항-CD16 항체로 염색되어 유동 세포계를 사용하여 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포를 분류합니다. 또한, 5 개의 하위 집단의 전사체 시퀀싱을 수행하여 IM에서 기능과 병원성 메커니즘을 탐색했습니다.
Introduction
인간 헤르페스 바이러스 4형으로도 알려진 γ 헤르페스 바이러스인 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 인구에서 어디에나 있으며성인 인구의 90% 이상에서 평생 잠복 감염을 확립합니다1. 대부분의 EBV 1차 감염은 소아기 및 청소년기에 발생하며, 일부 환자는 감염성 단핵구증(IM)2을 나타내며, 혈액 내 CD8+ T 세포에 의한 면역 반응 활성화 및 구인두에서 EBV에 감염된 B 세포의 일시적인 증식을 포함한 특징적인 면역병리를보입니다3. IM의 과정은 2-6 주 동안 지속될 수 있으며 대부분의 환자는 잘 회복됩니다4. 그러나 일부 개인은 이환율과 사망률이 높은 지속적이거나 재발적인 IM 유사 증상을 나타내며, 이는 만성 활동성 EBV 감염(CAEBV)으로 분류됩니다5. 또한 EBV는 중요한 발암 바이러스로, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL) 및 T/NK 세포 림프종6과 같은 상피 및 림프성 악성 종양을 포함한 다양한 악성 종양과 밀접한 관련이 있습니다. EBV는 50년 넘게 연구되어 왔지만 그 발병 기전과 림프구의 증식을 유도하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다.
여러 연구에서 전사체 시퀀싱에 의한 EBV 감염의 면역병리학에 대한 분자 서명을 조사했습니다. Zhong 등은 IM 또는 CAEBV가 있는 중국 어린이의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 전체 전사체 프로파일링을 분석하여 CD8+ T 세포 확장이 IM 그룹7에서 주로 발견되어 CD8+ T 세포가 IM에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 또 다른 연구에서는 EBV 재활성화 및기타 약제 모두에 의해 유발된 IM 환자보다 1차 EBV 감염으로 인한 IM 환자에서 EBV 특이적 세포독성 T 및 CD19+ B 세포의 비율이 낮고 CD8+ T 세포의 비율이 더 높다는 것을 발견했습니다8. B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. Al Tabaa 등은 IM9 동안 B 세포가 다클론으로 활성화되고 분화된 원형질모세포(CD19+, CD27+ 및 CD20- 및 CD138- 세포) 및 형질 세포(CD19+, CD27+ 및 CD20– 및 CD138+)를 발견했습니다. 또한, Zhong et al. 단핵구 마커 CD14 및 CD64가 CAEBV에서 상향 조절된다는 것을 발견했으며, 이는 단핵구가 항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 및 과민성 식균 작용을 통해 CAEBV의 세포 면역 반응에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다7. ALKA 등은 IM 또는 HL 환자 4 명으로부터 분류 된 MACS CD56희미한 CD16 + NK 세포의 전사체를 특성화하고 IM 및 HL의 NK 세포가 선천성 면역 및 케모카인 신호 전달 유전자를 하향 조절하여 NK 세포의 저 반응성을 담당 할 수 있음을 발견했습니다10. 또한, 그리노 등은 IM을 가진 개인의 10개의 PBMC로부터 분류된 CD8+ T 세포의 유전자 발현을 분석하였다. 그들은 IM에서 CD8+ T 세포의 상당 부분이 바이러스 특이적이고, 활성화되고, 분열하고, 이펙터 활성을 발휘할 준비가 되어 있다고 보고했습니다11. T 세포 매개 EBV 특이적 반응과 NK 세포 매개 비특이적 반응은 모두 1차 EBV 감염 동안 필수적인 역할을 합니다. 그러나 이러한 연구는 다양한 면역 세포 혼합물 또는 림프구의 특정 하위 집단의 전사체 결과만을 조사했으며, 이는 동일한 질병 상태의 IM 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능을 포괄적으로 비교하기에 충분하지 않습니다.
이 논문은 면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여 PBMC(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 자기 및 형광 표지된 세포를 자기 분리기 및 FACS를 사용하여 정제하거나 유세포분석에 의해 분석할 수 있다. RNA는 전사체 시퀀싱을 위해 정제된 세포로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 서로 다른 면역 세포의 특성화 및 유전자 발현을 가능하게 하여 EBV 감염의 면역병리학에 대한 이해를 넓힐 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 말초 혈액 면역 세포 하위 집단을 분류하는 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 연구에서는 IM 환자, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 어린이의 정맥혈 샘플을 연구 목표로 선택했습니다. IM 환자의 말초 혈액을 사용하는이 작업은 주로 다색 유세포 분석을 통해 다양한 세포 하위 집합의 비율을 분석하고 결정하는 데 중점을 둡니다. 전사체 시퀀싱은 주로 동일한 질병 상태에서 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 베이징 자연 과학 재단 (7222059) 및 의학을위한 CAMS 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
