Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa
Summary
Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.
Abstract
A mononucleose infecciosa (MI) é uma síndrome aguda associada principalmente à infecção primária pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os principais sintomas clínicos incluem febre irregular, linfadenopatia e linfócitos significativamente aumentados no sangue periférico. O mecanismo patogênico da MI ainda não está claro; não existe um método de tratamento eficaz para o efeito, estando disponíveis principalmente terapias sintomáticas. A principal questão na imunobiologia do EBV é por que apenas um pequeno subconjunto de indivíduos infectados apresenta sintomas clínicos graves e até desenvolve malignidades associadas ao EBV, enquanto a maioria dos indivíduos é assintomática por toda a vida com o vírus.
As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. As células natural killer (NK) são linfócitos inatos citotóxicos que são importantes para matar as células infectadas pelo EBV. A proporção de células T CD4+ diminui, enquanto a de células T CD8+ se expande dramaticamente durante a infecção aguda por EBV, e a persistência de células T CD8+ é importante para o controle vitalício da MI. Essas células imunes desempenham papéis importantes na MI, e suas funções precisam ser identificadas separadamente. Para este propósito, os monócitos são separados primeiro das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos IM usando microesferas CD14, uma coluna e um separador magnético.
Os PBMCs restantes são corados com peridinina-clorofila-proteína (PerCP)/Cianina 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/Cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e APC anti-CD16 para classificar células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK usando um citômetro de fluxo. Além disso, o sequenciamento do transcriptoma de cinco subpopulações foi realizado para explorar suas funções e mecanismos patogênicos na MI.
Introduction
O vírus Epstein-Barr (EBV), um γ-herpesvírus também conhecido como vírus do herpes humano tipo 4, é onipresente na população humana e estabelece infecção latente ao longo da vida em mais de 90% da população adulta1. A maioria das infecções primárias por EBV ocorre durante a infância e adolescência, com uma fração de pacientes manifestando mononucleose infecciosa (IM)2, mostrando imunopatologia característica, incluindo uma resposta imune ativada com células T CD8+ no sangue e uma proliferação transitória de células B infectadas por EBV na orofaringe3. O curso da MI pode durar de 2 a 6 semanas e a maioria dos pacientes se recupera bem4. No entanto, alguns indivíduos desenvolvem sintomas persistentes ou recorrentes semelhantes aos MI com alta morbidade e mortalidade, que é classificada como infecção crônica ativa por EBV (CAEBV)5. Além disso, o EBV é um importante vírus oncogênico, que está intimamente relacionado a uma variedade de malignidades, incluindo malignidades epitelióides e linfoides, como carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH) e linfoma de células T/NK6. Embora o EBV tenha sido estudado por mais de 50 anos, sua patogênese e o mecanismo pelo qual induz a proliferação de linfócitos não foram totalmente elucidados.
Diversos estudos têm investigado as assinaturas moleculares para a imunopatologia da infecção por EBV por sequenciamento de transcriptoma. Zhong et al. analisaram o perfil do transcriptoma completo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de crianças chinesas com MI ou CAEBV para descobrir que a expansão das células T CD8 + foi predominantemente encontrada no grupo IM7, sugerindo que as células T CD8 + podem desempenhar um papel importante na MI. Da mesma forma, outro estudo encontrou menores proporções de células T e CD19+ citotóxicas específicas para EBV e maiores porcentagens de células T CD8+ em pacientes com MI causada por infecção primária por EBV do que em pacientes com IM causada tanto pela reativação do EBV quanto por outros agentes8. As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. Al Tabaa et al. encontraram que as células B eram policlonalmente ativadas e diferenciadas em plasmoblastos (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmócitos (CD19+, CD27+ e CD20−, e CD138+) durante o IM9. Além disso, Zhong et al. descobriram que os marcadores de monócitos CD14 e CD64 foram regulados positivamente no CAEBV, sugerindo que os monócitos podem desempenhar um papel importante na resposta imune celular do CAEBV através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose hiperativa7. Alka et al. caracterizaram o transcriptoma de células NK CD56 dim CD16+ classificadas por MACS de quatro pacientes de IM ou HL e descobriram que as células NK de IM e HL tinham imunidade inata e genes de sinalização de quimiocinas desregulados, o que poderia ser responsável pela hiporresponsividade das células NK10. Além disso, Greenough et al. analisaram a expressão gênica de células T CD8+ classificadas de 10 PBMCs de indivíduos com MI. Relataram que uma grande proporção de células T CD8+ na MI eram específicas do vírus, ativadas, dividindo-se e preparadas para exercer atividades efetoras11. Tanto as respostas específicas do EBV mediadas por células T quanto as respostas inespecíficas mediadas por células NK desempenham papéis essenciais durante a infecção primária por EBV. No entanto, esses estudos investigaram apenas os resultados do transcriptoma da mistura diversificada de células imunes ou apenas uma certa subpopulação de linfócitos, o que não é suficiente para a comparação abrangente das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença.
Este artigo descreve um método que combina contas imunomagnéticas e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de PBMCs (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas usando um separador magnético e FACS ou analisadas por citometria de fluxo. O RNA pode ser extraído das células purificadas para sequenciamento do transcriptoma. Este método permitirá a caracterização e expressão gênica de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão da imunopatologia da infecção por EBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo representa uma maneira eficiente de classificar as subpopulações de células imunes do sangue periférico. Neste estudo, amostras de sangue venoso de pacientes com MI, portadores de EBV saudáveis e crianças não infectadas por EBV foram selecionadas como objetivo da pesquisa. Este trabalho utilizando o sangue periférico de pacientes com MI concentra-se principalmente em analisar e determinar as proporções de diferentes subconjuntos celulares através da citometria de fluxo multicolorida. O sequencia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7222059) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).
Materials
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
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