Summary

Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

Published: September 07, 2022
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Summary

Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.

Abstract

La mononucleosis infecciosa (IM) es un síndrome agudo asociado principalmente con la infección primaria por el virus de Epstein-Barr (VEB). Los principales síntomas clínicos incluyen fiebre irregular, linfadenopatía y aumento significativo de linfocitos en sangre periférica. El mecanismo patogénico de la MI aún no está claro; No existe un método de tratamiento eficaz para ello, con terapias principalmente sintomáticas disponibles. La pregunta principal en la inmunobiología del VEB es por qué solo un pequeño subconjunto de individuos infectados muestra síntomas clínicos graves e incluso desarrolla neoplasias malignas asociadas al VEB, mientras que la mayoría de los individuos son asintomáticos de por vida con el virus.

Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos citotóxicos que son importantes para matar las células infectadas por el VEB. La proporción de células T CD4 + disminuye, mientras que la de células T CD8 + se expande dramáticamente durante la infección aguda por VEB, y la persistencia de las células T CD8 + es importante para el control de por vida de la IM. Esas células inmunes juegan un papel importante en la IM, y sus funciones deben identificarse por separado. Para este propósito, los monocitos se separan primero de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos IM utilizando microperlas CD14, una columna y un separador magnético.

Los PBMC restantes se tiñen con peridina-clorofila-proteína (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, anticuerpos APC anti-CD56 y anticuerpos APC anti-CD16 para clasificar las células T CD4+, las células T CD8+, las células B y las células NK utilizando un citómetro de flujo. Además, se realizó la secuenciación del transcriptoma de cinco subpoblaciones para explorar sus funciones y mecanismos patogénicos en IM.

Introduction

El virus de Epstein-Barr (VEB), un γ-herpesvirus también conocido como virus del herpes humano tipo 4, es ubicuo en la población humana y establece una infección latente de por vida en más del 90% de la población adulta1. La mayoría de las infecciones primarias por VEB ocurren durante la infancia y la adolescencia, con una fracción de pacientes que se manifiestan con mononucleosis infecciosa (IM)2, mostrando inmunopatología característica, incluida una respuesta inmune activada con células T CD8 + en sangre y una proliferación transitoria de células B infectadas por VEB en la orofaringe3. El curso de la IM puede durar de 2 a 6 semanas y la mayoría de los pacientes se recuperan bien4. Sin embargo, algunos individuos desarrollan síntomas persistentes o recurrentes similares a los IM con alta morbilidad y mortalidad, que se clasifica como infección crónica activa por VEB (VEB)5. Además, el VEB es un virus oncogénico importante, que está estrechamente relacionado con una variedad de neoplasias malignas, incluidas las neoplasias epitelioides y linfoides como el carcinoma nasofaríngeo, el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin (LH) y el linfoma de células T/NK6. Aunque el VEB se ha estudiado durante más de 50 años, su patogénesis y el mecanismo por el cual induce la proliferación de linfocitos no se han dilucidado completamente.

Varios estudios han investigado las firmas moleculares para la inmunopatología de la infección por VEB mediante secuenciación del transcriptoma. Zhong et al. analizaron el perfil del transcriptoma completo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de niños chinos con IM o CAEBV para encontrar que la expansión de las células T CD8 + se encontró predominantemente en el grupo IM7, lo que sugiere que las células T CD8 + pueden desempeñar un papel importante en la IM. Del mismo modo, otro estudio encontró menores proporciones de células T y CD19+ B citotóxicas específicas del VEB y mayores porcentajes de linfocitos T CD8+ en pacientes con MI causada por infección primaria por VEB que en pacientes con MI causada tanto por reactivación del VEB como por otros agentes8. Las células B están involucradas primero en la IM porque los receptores de EBV se presentan en su superficie. Al Tabaa et al. encontraron que las células B se activaron policlonalmente y se diferenciaron en plasmablastos (CD19+, CD27+ y CD20−, y células CD138−) y células plasmáticas (CD19+, CD27+ y CD20, y CD138+) durante IM9. Además, Zhong et al. encontraron que los marcadores de monocitos CD14 y CD64 estaban regulados al alza en CAEBV, lo que sugiere que los monocitos pueden desempeñar un papel importante en la respuesta inmune celular de CAEBV a través de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y fagocitosis hiperactiva7. Alka et al. caracterizaron el transcriptoma de células NK CD56dim CD16+ clasificadas por MACS de cuatro pacientes de IM o HL y encontraron que las células NK de IM y HL tenían inmunidad innata regulada a la baja y genes de señalización de quimiocinas, que podrían ser responsables de la hiporeactividad de las células NK10. Además, Greenough et al. analizaron la expresión génica de células T CD8 + clasificadas de 10 PBMC de individuos con IM. Informaron que una gran proporción de células T CD8 + en IM eran específicas del virus, activadas, en división y preparadas para ejercer actividades efectoras11. Tanto las respuestas mediadas por células T, específicas del VEB, como las respuestas no específicas mediadas por células NK desempeñan funciones esenciales durante la infección primaria por VEB. Sin embargo, estos estudios solo investigaron los resultados del transcriptoma de la mezcla diversa de células inmunes o solo una cierta subpoblación de linfocitos, lo que no es suficiente para la comparación exhaustiva de las características moleculares y funciones de diferentes subpoblaciones de células inmunes en niños con MI en el mismo estado de enfermedad.

Este documento describe un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para aislar y analizar subpoblaciones definidas de células inmunes de PBMC (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células NK). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden purificarse usando un separador magnético y FACS o analizarse por citometría de flujo. El ARN se puede extraer de las células purificadas para la secuenciación del transcriptoma. Este método permitirá la caracterización y expresión génica de diferentes células inmunes en los mismos estados de enfermedad de individuos con MI, lo que ampliará nuestra comprensión de la inmunopatología de la infección por VEB.

Protocol

Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes con MI (n = 3), portadores sanos del VEB (n = 3) y niños no infectados por el VEB (n = 3). Se reclutaron voluntarios del Hospital de Niños de Beijing, la Universidad Médica Capital, y todos los estudios fueron aprobados éticamente. La aprobación ética fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: [2021]-E-056-Y). Se renunció al consentimiento informado de los pacientes ya que el estudio solo…

Representative Results

Referencia de la estrategia de compuertaLa estrategia de gating utilizada para ordenar las cuatro subpoblaciones de linfocitos se muestra en la Figura 1. Brevemente, los linfocitos se seleccionan (P1) en un diagrama de puntos que muestra la granulosidad (SSC-A) versus el tamaño (FSC-A). Luego, se seleccionan celdas individuales (P2) en un diagrama de puntos que muestra el tamaño (FSC-A) frente a la dispersión directa (FSC-H), mientras que las celdas dobles se excluyen…

Discussion

Este protocolo representa una forma eficiente de clasificar las subpoblaciones de células inmunes de sangre periférica. En este estudio, se seleccionaron muestras de sangre venosa de pacientes con MI, portadores sanos del VEB y niños no infectados por el VEB como objetivo de la investigación. Este trabajo utilizando la sangre periférica de pacientes de IM se centra principalmente en analizar y determinar las proporciones de diferentes subconjuntos celulares a través de la citometría de flujo multicolor. La secuenc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7222059) y el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).

Materials

APC anti-human CD16 Biolegend 302012 Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM) Biolegend 362504 Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4 Biolegend 344616 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) Becton, Dickinson and Company 644832 Cell sort
CD14 MicroBeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 microbeads
Cell ctng slides BIO RAD 1450016 Cell count
Centrifuge tubes Falcon 35209715 15 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium) Beyotime ST1303 EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes Becton, Dickinson and Company  367862  EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19 Biolegend 302206 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque
LS Separation columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Separation columns
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302 Magnetic bead separator
PE anti-human CD8 Biolegend 344706 Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 Biolegend 344808 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Polystyrene round bottom tubes Falcon 352235 5 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagent Ambion 15596024 Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
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Zhang, L., Liu, M., Zhang, M., Ai, J., Tian, J., Wang, R., Xie, Z. Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis. J. Vis. Exp. (187), e64212, doi:10.3791/64212 (2022).

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