정점 장내구 모델에서 루시퍼 옐로우를 사용한 장 투과성 측정
Summary
본 프로토콜은 장 투과성을 결정하기 위해 정점 엔터로이드 모델에서 루시퍼 옐로우를 활용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 괴사 성 장염과 같은 염증성 장 질환을 모델링하는 장내 세포에서 세포 투과성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
엔테로이드는 괴사성 장염(NEC)과 같은 염증성 장 질환 연구에서 떠오르는 연구 도구입니다. 그들은 전통적으로 상피 세포의 정점 표면이 내부 내강을 향하는 기저측(BO) 형태로 자랍니다. 이 모델에서는 치료 및 실험을 위해 엔테로이드의 내강 표면에 접근하는 것이 어려워 숙주-병원체 상호 작용을 연구하는 능력이 제한됩니다. 이를 피하기 위해 괴사성 장염에 대한 신생아 정점(AO) 모델이 만들어졌습니다. 장 상피 세포 투과성 변화는 NEC에 대한 병리학적이기 때문에 이 프로토콜은 루시퍼 옐로우(LY)를 세포 투과성의 마커로 사용하여 설명합니다. LY는 세 가지 주요 세포 간 경로(기공, 누출 및 제한되지 않음)를 통해 장 상피 장벽을 가로지릅니다. AO 모델에서 LY를 사용하면 NEC의 투과성에 대한 광범위한 연구가 가능합니다. IRB 승인 및 부모의 동의에 따라 인간 조산 신생아로부터 장 조직의 수술 샘플을 수집했습니다. 장 줄기 세포는 지하실 분리 를 통해 수확되어 장내 증식에 사용되었습니다. 엔테로이드는 성숙할 때까지 성장한 다음 AO로 변형되거나 BO 형태로 남았습니다. 이들은 치료되지 않았거나 (대조군) 또는 지질 다당류 (LPS)로 처리되었고 시험관 내 NEC의 유도를위한 저산소 조건을 받았다. 투과성을 평가하기 위해 LY를 사용하였다. 정점 단백질 zonula occludens-1 및 기저측 단백질 β-catenin의 면역형광 염색 결과 AO 형태가 확인되었습니다. LPS와 저산소증으로 치료받은 AO 및 BO 엔테로이드는 대조군에 비해 세포 주위투과성이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. AO 및 BO 엔테로이드 모두 대조군에 비해 처리된 엔테로이드의 내강으로의 LY 흡수가 증가한 것으로 나타났습니다. AO 엔테로이드 모델에서 LY를 활용하면 세포 투과성의 세 가지 주요 경로를 모두 조사할 수 있습니다. 또한 숙주-병원체 상호 작용과 이것이 BO 엔터로이드 모델과 비교하여 투과성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 조사할 수 있습니다.
Introduction
엔테로이드는 장기 제한 인간 장 줄기 세포 1,2에서 파생된 3차원(3D) 구조입니다. 그들은 전적으로 상피 계통으로 구성되어 있으며 분화 된 모든 장 상피 세포 유형2을 포함합니다. 엔테로이드는 또한 내부 구획을 형성하는 정점 내강 표면과 주변 매체를 향한 기저측 표면으로 구성된 세포 극성을 유지합니다. 엔테로이드는 생성 된 호스트의 특성을 보존한다는 점에서 고유 한 모델입니다3. 따라서 미숙아에서 생성 된 엔터 로이드는 괴사 성 장염 (NEC)과 같이이 집단에 주로 영향을 미치는 질병을 조사하는 데 유용한 모델을 나타냅니다.
전통적인 엔터로이드 모델은 엔테로이드가 기저막 매트릭스(BMM)의 돔에 둘러싸인 기저측부(BO) 형태로 재배됩니다. BMM은 엔터로이드가 외부에 기저측 표면이 있는 3D 구조를 유지하도록 유도합니다. BO 엔테로이드는 2차원(2D) 1차 인간 세포주와 생체 내 동물 모델 2,4 사이의 간극을 해소하는 NEC에 적합한 모델입니다. NEC는 LPS 또는 박테리아와 같은 병원체를 엔테로이드 주변 매체에 배치한 다음 저산소 조건 2,3에 노출시켜 엔테로이드에서 유도됩니다. BO 엔테로이드 NEC 모델의 과제는 생체 내 정점 표면에서 발생하는 숙주-병원체 상호 작용에 대한 효과적인 연구를 허용하지 않는다는 것입니다. 장 투과성의 변화는 이러한 숙주-병원체 상호 작용 때문입니다. 투과성이 질병의 병태생리학적 기초에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 이해하려면 정점 표면을 치료하는 모델을 만들어야 합니다.
Co 등은 성숙한 BO 엔테로이드가 BMM 돔을 제거하고 배지5에 재현탁시킴으로써 정점 (AO) 형태를 형성하도록 유도 할 수 있음을 처음으로 입증했습니다. 이 기사는 AO enteroids가 올바른 상피 극성을 유지하고, 모든 장 세포 유형을 포함하고, 장 상피 장벽을지지하고, 정점 표면5에 대한 접근을 허용한다는 것을 입증했습니다. AO 엔테로이드를 NEC 모델로 사용하면 질병 과정의 생리학적 재현과 숙주-병원체 상호 작용에 대한 연구를 달성할 수 있습니다.
NEC의 병태생리학에 대한 한 가지 주요 기여는 증가된 장 투과성입니다6. 시험관내 7에서 장 투과성을 시험하는 방법으로 여러 분자가 제안되었습니다. 이들 중에서, 루시퍼 옐로우(LY)는 각각 428nm 및 540nm에서 여기 및 방출 피크를 갖는 친수성 염료이다(8). 모든 주요 paracellular 경로를 통과하기 때문에 혈액 뇌 및 장 상피 장벽 8,9를 포함한 다양한 응용 분야에서 paracellular 투과성을 평가하는 데 사용되었습니다. LY의 전통적인 적용은 반투과성 표면10 상의 단층으로 성장한 세포를 사용한다. LY는 정점 표면에 적용되고 세포 내 단단한 접합 단백질을 통과하여 기저측에 모입니다. 기저측 구획의 LY 농도가 높을수록 후속 장 상피 세포 장벽 파괴 및 투과성 증가와 함께 단단한 접합 단백질이 감소했음을 나타냅니다10. 또한 3D BO 엔터로이드 모델에서 설명되었으며, 여기서 LY가 미디어에 추가되고 개별 엔터로이드가 내강(11) 내로 LY의 흡수를 위해 이미징되었습니다. 이를 통해 LY 흡수의 시각화를 통한 정성 분석이 가능하지만 정량 분석은 제한적입니다. 이 프로토콜은 3D 방향을 유지하면서 AO 엔테로이드에서 체외 NEC 엔터로이드 모델을 사용하여 LY를 사용하여 세포내 투과성을 평가하는 고유한 기술을 설명합니다. 이 방법은 투과성의 정성 및 정량 분석 모두에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장 투과성은 복잡하고 상피 장벽 기능을 반영합니다. 장 장벽은 세포횡단 및 세포주위 수송(14)을 매개하는 상피 세포의 단일층을 포함한다. 세포부투과성은 상피 세포(14) 사이의 공간을 밀봉하는 단단한 접합 단백질에 의존한다. 이 초세포 수송 내에는 분자가 교차할 수 있는 세 가지 뚜렷한 경로가 있습니다: 기공, 누출 및 무제한15. 공극 경?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
로체스터 대학 의료 센터의 Ashley Nelson에게 엔터 로이드 모델에 대한 그녀의 도구 적 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 오클라호마 대학교 소아외과에도 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [NIH Grant R03 DK117216-01A1], 오클라호마 성인 줄기 세포 연구 센터 및 장로교 건강 재단 보조금 # 20180587의 지원을 받아 오클라호마 대학 건강 과학 센터의 외과에 수여되었습니다.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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