Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model
Summary
Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.
Abstract
Enteroïden zijn een opkomend onderzoeksinstrument in de studie van inflammatoire darmziekten zoals necrotiserende enterocolitis (NEC). Ze worden traditioneel gekweekt in de basolaterale (BO) conformatie, waarbij het apicale oppervlak van de epitheelcel naar het binnenste lumen is gericht. In dit model is de toegang tot het luminale oppervlak van enteroïden voor behandeling en experimenten een uitdaging, wat het vermogen beperkt om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Om dit te omzeilen, werd een neonatale apicale-out (AO) -model voor necrotiserende enterocolitis gemaakt. Aangezien veranderingen in de permeabiliteit van intestinale epitheelcellen pathognomonisch zijn voor NEC, schetst dit protocol het gebruik van lucifergeel (LY) als een marker van paracellulaire permeabiliteit. LY doorkruist de intestinale epitheliale barrière via alle drie de belangrijkste paracellulaire paden: porie, lek en onbeperkt. Het gebruik van LY in een AO-model maakt een bredere studie van de permeabiliteit in NEC mogelijk. Na IRB-goedkeuring en ouderlijke toestemming werden chirurgische monsters van darmweefsel verzameld van menselijke premature pasgeborenen. Intestinale stamcellen werden geoogst via cryptisolatie en gebruikt om enteroïden te laten groeien. Enteroïden werden tot volwassenheid gekweekt en vervolgens AO getransformeerd of achtergelaten in BO-conformatie. Deze werden niet behandeld (controle) of werden behandeld met lipopolysaccharide (LPS) en onderworpen aan hypoxische voorwaarden voor de inductie van in vitro NEC. LY werd gebruikt om te beoordelen op permeabiliteit. Immunofluorescente kleuring van het apicale eiwit zonula occludens-1 en basolateraal eiwit β-catenine bevestigde AO-conformatie. Zowel AO- als BO-enteroïden behandeld met LPS en hypoxie vertoonden een significant verhoogde paracellulaire permeabiliteit in vergelijking met controles. Zowel AO- als BO-enteroïden vertoonden een verhoogde opname van LY in het lumen van de behandelde enteroïden in vergelijking met controles. Het gebruik van LY in een AO enteroïde model maakt het mogelijk om alle drie de belangrijkste routes van paracellulaire permeabiliteit te onderzoeken. Het maakt bovendien het onderzoek mogelijk naar gastheer-pathogeen interacties en hoe dit de permeabiliteit kan beïnvloeden in vergelijking met het BO enteroïde model.
Introduction
Enteroïden zijn driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van orgaanbeperkte menselijke darmstamcellen 1,2. Ze bestaan volledig uit epitheliale afstamming en bevatten alle gedifferentieerde intestinale epitheelceltypen2. Enteroïden behouden ook cellulaire polariteit die bestaat uit een apicale luminale oppervlakte die een binnencompartiment vormt en een basolateraal oppervlak dat naar de omliggende media is gericht. Enteroïden zijn een uniek model omdat ze de kenmerken behouden van de gastheer waaruit ze zijn gegenereerd3. Enteroïden gegenereerd uit premature menselijke baby’s vertegenwoordigen dus een model dat nuttig is voor het onderzoeken van ziekten die voornamelijk deze populatie treffen, zoals necrotiserende enterocolitis (NEC).
Het traditionele enteroïde model wordt gekweekt in een basolaterale (BO) conformatie, waarbij de enteroïde is ingepakt in een koepel van keldermembraanmatrix (BMM). BMM induceert de enteroïde om een 3D-structuur te behouden met het basolaterale oppervlak aan de buitenkant. BO-enteroïden zijn een geschikt model voor NEC dat de kloof overbrugt tussen tweedimensionale (2D) primaire menselijke cellijnen en in vivo diermodellen 2,4. NEC wordt geïnduceerd in enteroïden door pathogenen zoals LPS of bacteriën in de media rond de enteroïden te plaatsen, gevolgd door blootstelling aan hypoxische aandoeningen 2,3. De uitdaging met het BO enteroïde NEC-model is dat het geen effectieve studie van gastheer-pathogeeninteracties mogelijk maakt, die in vivo op het apicale oppervlak plaatsvinden. Veranderingen in de darmdoorlaatbaarheid zijn te wijten aan deze gastheer-pathogeen interacties. Om beter te begrijpen hoe permeabiliteit de pathofysiologische basis van ziekte beïnvloedt, moet een model worden gemaakt dat betrekking heeft op de behandeling van het apicale oppervlak.
Co et al. waren de eersten die aantoonden dat volwassen BO-enteroïden kunnen worden geïnduceerd om een apicale (AO) conformatie te vormen door de BMM-koepels te verwijderen en ze in media5 te resuspenderen. Dit artikel toonde aan dat AO-enteroïden de juiste epitheliale polariteit behielden, alle darmceltypen bevatten, de intestinale epitheelbarrière handhaafden en toegang gaven tot het apicale oppervlak5. Het gebruik van AO-enteroïden als NEC-model bereikt een fysiologische reproductie van het ziekteproces en studie van gastheer-pathogeeninteracties.
Een belangrijke bijdrage aan de pathofysiologie van NEC is verhoogde darmdoorlaatbaarheid6. Verschillende moleculen zijn voorgesteld als een manier om te testen op intestinale permeabiliteit in vitro7. Onder deze, lucifer geel (LY) is een hydrofiele kleurstof met excitatie en emissie pieken bij 428 nm en 540 nm, respectievelijk8. Terwijl het alle belangrijke paracellulaire routes doorkruist, is het gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te evalueren in verschillende toepassingen, waaronder de bloed-hersenen en intestinale epitheliale barrières 8,9. De traditionele toepassing van LY maakt gebruik van cellen gekweekt in monolagen op een semi-permeabel oppervlak10. LY wordt aangebracht op het apicale oppervlak en kruist paracellulaire tight junction-eiwitten om samen te komen aan de basolaterale kant. Hogere LY-concentraties in het basolaterale compartiment wijzen op verminderde tight junction-eiwitten met daaropvolgende intestinale epitheelcelbarrièreafbraak en verhoogde permeabiliteit10. Het is ook beschreven in 3D BO enteroid modellen waar LY werd toegevoegd aan de media en individuele enteroïden werden afgebeeld voor opname van LY in het lumen11. Hoewel dit kwalitatieve analyse mogelijk maakt via de visualisatie van LY-opname, is kwantitatieve analyse beperkt. Dit protocol schetst een unieke techniek die LY gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te beoordelen met behulp van een in vitro NEC enteroïde model in AO enteroïden met behoud van 3D-oriëntatie. Deze methode kan worden gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van de permeabiliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinale permeabiliteit is complex en weerspiegelt de epitheliale barrièrefunctie. De darmbarrière bestaat uit een enkele laag epitheelcellen die transcellulair en paracellulair transport bemiddelt14. Paracellulaire permeabiliteit is afhankelijk van tight junction-eiwitten die de ruimte tussen epitheelcellen afdichten14. Binnen dit paracellulaire transport zijn er drie verschillende paden waarlangs moleculen elkaar kunnen kruisen: porie, lek en onbeperkt<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Ashley Nelson van het University of Rochester Medical Center bedanken voor haar instrumentele hulp bij ons enteroïde model. We willen ook de afdeling Kinderchirurgie van de Universiteit van Oklahoma bedanken voor hun steun aan dit project. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], het Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research en de Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 toegekend aan de afdeling Chirurgie van het Health Sciences Center van de Universiteit van Oklahoma.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
