根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定
Summary
本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。
Abstract
エンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)などの炎症性腸疾患の研究における新たな研究ツールです。それらは伝統的に、上皮細胞の頂端表面が内腔に面する基底外側外側(BO)立体配座で成長しています。このモデルでは、治療と実験のためにエンテロイドの管腔表面にアクセスすることは困難であり、宿主と病原体の相互作用を研究する能力が制限されています。これを回避するために、壊死性腸炎の新生児頂端アウト(AO)モデルが作成されました。腸管上皮細胞透過性の変化はNECにとって病的であるため、このプロトコルでは、細胞透過性のマーカーとしてルシファーイエロー(LY)を使用することを概説しています。LYは、3つの主要な傍細胞経路(孔、漏れ、および無制限) すべてを介して 腸上皮バリアを通過します。AOモデルでLYを使用すると、NECの透過性をより広く研究できます。IRBの承認と親の同意に続いて、腸組織の外科的サンプルがヒトの早産児から収集されました。腸幹細胞は陰窩分離 によって 採取され、エンテロイドの増殖に使用されました。エンテロイドは成熟するまで成長した後、AOを形質転換するか、BOコンフォメーションのままにしました。これらは、処理されていない(対照)か、リポ多糖(LPS)で処理され、 in vitro NECの誘導のために低酸素条件にかけられた。LYは透過性を評価するために使用されました。頂端タンパク質帯閉塞-1および基底外側タンパク質β-カテニンの免疫蛍光染色により、AO立体構造が確認された。LPSおよび低酸素で処理されたAOおよびBOエンテロイドは、対照と比較して有意に増加した傍細胞透過性を示した。AOエンテロイドとBOエンテロイドの両方が、対照と比較して、処理されたエンテロイドの内腔へのLYの取り込みの増加を示しました。AO腸様モデルにおけるLYの利用は、傍細胞透過性の3つの主要な経路すべての研究を可能にする。さらに、宿主と病原体の相互作用の調査と、これがBO腸介類モデルと比較して透過性にどのように影響するかを調べることができます。
Introduction
エンテロイドは、臓器制限ヒト腸管幹細胞に由来する3次元(3D)構造である1,2。それらは完全に上皮系譜で構成されており、分化した腸上皮細胞タイプ2をすべて含んでいます。エンテロイドはまた、内部コンパートメントを形成する頂端管腔表面と周囲の媒体に面する基底外側表面からなる細胞極性を維持する。エンテロイドは、それらが生成された宿主の特性を保持するという点でユニークなモデルです3。したがって、未熟児のヒト乳児から生成されたエンテロイドは、壊死性腸炎(NEC)など、主にこの集団に影響を与える疾患の調査に役立つモデルを表しています。
従来の腸管モデルは、基底外側(BO)コンフォメーションで成長し、腸管は基底膜マトリックス(BMM)のドームに包まれています。BMMは、基底外側表面が外側にある3D構造を維持するように腸管を誘導します。BOエンテロイドは、2次元(2D)初代ヒト細胞株とin vivo動物モデルの間のギャップを埋めるNECに適したモデルです2,4。NECは、LPSや細菌などの病原体をエンテロイド周囲の培地に入れ、続いて低酸素条件に曝露することによってエンテロイドに誘導されます2,3。BO腸内NECモデルの課題は、in vivoで頂端表面で発生する宿主と病原体の相互作用の効果的な研究を可能にしないことです。腸透過性の変化は、これらの宿主 – 病原体相互作用によるものである。透過性が疾患の病態生理学的根拠にどのように影響するかをよりよく理解するためには、頂端表面の治療を含むモデルを作成する必要があります。
Coらは、 成熟したBOエンテロイドがBMMドームを除去し、それらを培地5に再懸濁することによって頂端アウト(AO)コンフォメーションを形成するように誘導され得ることを最初に実証した。この記事は、AOエンテロイドが正しい上皮極性を維持し、すべての腸細胞タイプを含み、腸上皮バリアを支持し、頂端表面へのアクセスを可能にすることを実証しました5。AOエンテロイドをNECモデルとして使用することで、疾患プロセスの生理学的再現と宿主-病原体相互作用の研究を実現します。
NECの病態生理学への主要な寄与の1つは、腸透過性の増加です6。インビトロ7で腸透過性を試験する方法として、いくつかの分子が提案されている。これらのうち、ルシファーイエロー(LY)は、それぞれ428nmおよび540nmに励起および発光ピークを有する親水性色素である8。すべての主要な傍細胞経路を通過するため、血液脳および腸上皮バリアを含むさまざまなアプリケーションで傍細胞透過性を評価するために使用されてきました8,9。LYの伝統的な用途は、半透性表面10上で単層で増殖した細胞を使用する。LYは頂端表面に塗布され、傍細胞タイトジャンクションタンパク質を交差して基底外側に集まります。基底外側コンパートメントにおけるより高いLY濃度は、タイトジャンクションタンパク質の減少とそれに続く腸上皮細胞バリアの破壊および透過性の増加を示しています10。また、LYを培地に追加し、個々のエンテロイドを内腔11へのLYの取り込みのために画像化した3D BO腸内モデルでも説明されています。これにより、LY取り込みの可視化による定性分析は可能になりますが、定量分析は限られています。このプロトコルは、3D配向を維持しながら、AOエンテロイドのin vitroNEC腸内モデルを使用して傍細胞透過性を評価するためにLYを使用する独自の技術を概説します。この方法は、透過性の定性的および定量的分析の両方に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
腸透過性は複雑であり、上皮バリア機能を反映しています。腸管バリアは、経細胞および傍細胞輸送を媒介する上皮細胞の単層を含む14。傍細胞透過性は、上皮細胞14間の空間を封鎖するタイトジャンクションタンパク質に依存する。この傍細胞輸送には、分子が通過できる3つの異なる経路があります:細孔、漏れ、および無制限の15。細?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ロチェスター大学医療センターのアシュリーネルソンが腸内モデルに役立ったことに感謝します。また、オクラホマ大学の小児外科部門にも、このプロジェクトを支援してくださったことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所[NIHグラントR03 DK117216-01A1]、オクラホマ成人幹細胞研究センター、および長老派健康財団助成金#20180587によってオクラホマ大学健康科学センターの外科に授与されました。
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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