Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out
Summary
El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.
Abstract
Los enteroides son una herramienta de investigación emergente en el estudio de enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante (ECN). Tradicionalmente se cultivan en la conformación basolateral hacia fuera (BO), donde la superficie apical de la célula epitelial se enfrenta a la luz interna. En este modelo, el acceso a la superficie luminal de los enteroides para el tratamiento y la experimentación es un desafío, lo que limita la capacidad de estudiar las interacciones huésped-patógeno. Para evitar esto, se creó un modelo de salida apical neonatal (AO) para la enterocolitis necrosante. Dado que los cambios en la permeabilidad de las células epiteliales intestinales son patognomónicos para la ECN, este protocolo describe el uso del amarillo lucifer (LY) como marcador de permeabilidad paracelular. LY atraviesa la barrera epitelial intestinal a través de las tres vías paracelulares principales: poro, fuga y sin restricciones. El uso de LY en un modelo AO permite un estudio más amplio de la permeabilidad en ECN. Después de la aprobación del IRB y el consentimiento de los padres, se recolectaron muestras quirúrgicas de tejido intestinal de neonatos prematuros humanos. Las células madre intestinales se cosecharon mediante aislamiento de cripta y se utilizaron para cultivar enteroides. Los enteroides se cultivaron hasta la madurez y luego se transformaron AO o se dejaron en conformación BO. Estos no fueron tratados (control) o fueron tratados con lipopolisacáridos (LPS) y sometidos a condiciones hipóxicas para la inducción de ECN in vitro . LY se utilizó para evaluar la permeabilidad. La tinción inmunofluorescente de la proteína apical zonula occludens-1 y la proteína basolateral β-catenina confirmaron la conformación AO. Tanto los enteroides AO como BO tratados con LPS e hipoxia demostraron un aumento significativo de la permeabilidad paracelular en comparación con los controles. Tanto los enteroides AO como BO mostraron una mayor captación de LY en la luz de los enteroides tratados en comparación con los controles. La utilización de LY en un modelo enteroide AO permite la investigación de las tres vías principales de permeabilidad paracelular. Además, permite la investigación de las interacciones huésped-patógeno y cómo esto puede afectar la permeabilidad en comparación con el modelo enteroide BO.
Introduction
Los enteroides son estructuras tridimensionales (3D) derivadas de células madre intestinales humanas con órganos restringidos 1,2. Están formados enteramente por linaje epitelial y contienen todos los tipos de células epiteliales intestinales diferenciadas2. Los enteroides también mantienen la polaridad celular formada por una superficie luminal apical que forma un compartimento interno y una superficie basolateral frente al medio circundante. Los enteroides son un modelo único en el sentido de que conservan las características del huésped a partir del cual se generaron3. Por lo tanto, los enteroides generados a partir de bebés humanos prematuros representan un modelo útil para investigar enfermedades que afectan principalmente a esta población, como la enterocolitis necrosante (ECN).
El modelo enteroide tradicional se cultiva en una conformación basolateral hacia fuera (BO), donde el enteroide está encerrado en una cúpula de matriz de membrana basal (BMM). BMM induce al enteroide a mantener una estructura 3D con la superficie basolateral en el exterior. Los enteroides BO son un modelo adecuado para NEC que cierra la brecha entre las líneas celulares humanas primarias bidimensionales (2D) y los modelos animales in vivo 2,4. La NEC es inducida en enteroides mediante la colocación de patógenos como LPS o bacterias en los medios que rodean los enteroides, seguido de la exposición a condiciones hipóxicas 2,3. El desafío con el modelo BO enteroide NEC es que no permite el estudio efectivo de las interacciones huésped-patógeno, que ocurren en la superficie apical in vivo. Los cambios en la permeabilidad intestinal se deben a estas interacciones huésped-patógeno. Para comprender mejor cómo la permeabilidad afecta la base fisiopatológica de la enfermedad, se debe crear un modelo que implique el tratamiento de la superficie apical.
Co et al. fueron los primeros en demostrar que los enteroides BO maduros pueden ser inducidos a formar una conformación apical-out (AO) mediante la eliminación de los domos BMM y su resuspensión en medios5. Este artículo demostró que los enteroides AO mantuvieron la polaridad epitelial correcta, contenían todos los tipos de células intestinales, sostenían la barrera epitelial intestinal y permitían el acceso a la superficie apical5. El uso de enteroides AO como modelo NEC logra una reproducción fisiológica del proceso de la enfermedad y el estudio de las interacciones huésped-patógeno.
Uno de los principales contribuyentes a la fisiopatología de la ECN es el aumento de la permeabilidad intestinal6. Se han propuesto varias moléculas como una forma de probar la permeabilidad intestinal in vitro7. Entre estos, el amarillo lucifer (LY) es un colorante hidrófilo con picos de excitación y emisión a 428 nm y 540 nm, respectivamente8. A medida que atraviesa todas las principales vías paracelulares, se ha utilizado para evaluar la permeabilidad paracelular en diversas aplicaciones, incluyendo las barreras epiteliales hematoencefálicas eintestinales 8,9. La aplicación tradicional de LY utiliza células cultivadas en monocapas sobre una superficie semipermeable10. LY se aplica a la superficie apical y cruza a través de proteínas de unión estrecha paracelular para congregarse en el lado basolateral. Las concentraciones más altas de LY en el compartimiento basolateral indican una disminución de las proteínas de unión estrecha con la posterior ruptura de la barrera de las células epiteliales intestinales y una mayor permeabilidad10. También se ha descrito en modelos enteroides 3D BO donde LY se agregó a los medios y se obtuvieron imágenes de enteroides individuales para la absorción de LY en el lumen11. Aunque esto permite el análisis cualitativo a través de la visualización de la aceptación de LY, el análisis cuantitativo es limitado. Este protocolo describe una técnica única que utiliza LY para evaluar la permeabilidad paracelular utilizando un modelo enteroide NEC in vitro en enteroides AO mientras se mantiene la orientación 3D. Este método se puede utilizar para el análisis cualitativo y cuantitativo de la permeabilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
La permeabilidad intestinal es compleja y refleja la función de barrera epitelial. La barrera intestinal comprende una sola capa de células epiteliales que media el transporte transcelular y paracelular14. La permeabilidad paracelular depende de proteínas de unión estrecha que sellan el espacio entre las células epiteliales14. Dentro de este transporte paracelular, hay tres vías distintas por las cuales las moléculas pueden cruzar: poro, fuga y sin restricciones<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Ashley Nelson del Centro Médico de la Universidad de Rochester por su ayuda instrumental con nuestro modelo enteroide. También nos gustaría agradecer a la División de Cirugía Pediátrica de la Universidad de Oklahoma por su apoyo a este proyecto. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud [NIH Grant R03 DK117216-01A1], el Centro de Investigación de Células Madre Adultas de Oklahoma y la Subvención # 20180587 de la Fundación de Salud Presbiteriana otorgada al Departamento de Cirugía del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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