Apikal-Out Enteroid Modelde Lucifer Sarı Kullanarak Bağırsak Geçirgenliğinin Belirlenmesi
Summary
Mevcut protokol, bağırsak geçirgenliğini belirlemek için apikal-dışarı enteroid modelinde lusifer sarısı kullanan bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, nekrotizan enterokolit gibi inflamatuar bağırsak hastalıklarını modelleyen enteroidlerde parasellüler geçirgenliği belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi enflamatuar bağırsak hastalıklarının incelenmesinde ortaya çıkan bir araştırma aracıdır. Geleneksel olarak, epitel hücresinin apikal yüzeyinin iç lümene baktığı bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilirler. Bu modelde, tedavi ve deney için enteroidlerin luminal yüzeyine erişim zordur, bu da konakçı-patojen etkileşimlerini inceleme yeteneğini sınırlar. Bunu atlatmak için, nekrotizan enterokolit için bir yenidoğan apikal-out (AO) modeli oluşturuldu. İntestinal epitel hücre geçirgenliği değişiklikleri NEC için patognomonik olduğundan, bu protokol parasellüler geçirgenliğin bir belirteci olarak lusifer sarısı (LY) kullanımını özetlemektedir. LY, bağırsak epitel bariyerini üç ana parasellüler yolun hepsinden geçirir : gözenek, sızıntı ve kısıtlamasız. Bir AO modelinde LY kullanmak, NEC’de geçirgenliğin daha geniş bir çalışmasına izin verir. IRB onayı ve ebeveyn onayını takiben, insan preterm yenidoğanlardan bağırsak dokusunun cerrahi örnekleri toplandı. Bağırsak kök hücreleri kript izolasyonu yoluyla toplandı ve enteroidleri büyütmek için kullanıldı. Enteroidler olgunluğa erişti ve daha sonra AO’yu dönüştürdü veya BO konformasyonunda bırakıldı. Bunlar ya tedavi edilmedi (kontrol) ya da lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edildi ve in vitro NEC’nin indüksiyonu için hipoksik koşullara maruz bırakıldı. Geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanıldı. Apikal protein zonula oklüdens-1 ve bazolateral protein β-kateninin immünofloresan boyanması AO konformasyonunu doğruladı. LPS ve hipoksi ile tedavi edilen AO ve BO enteroidleri, kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmış parasellüler geçirgenlik göstermiştir. Hem AO hem de BO enteroidleri, kontrollere kıyasla tedavi edilen enteroidlerin lümenine LY’nin alımının arttığını göstermiştir. Bir AO enteroid modelinde LY’nin kullanılması, parasellüler geçirgenliğin üç ana yolunun hepsinin araştırılmasına izin verir. Ek olarak, konakçı-patojen etkileşimlerinin araştırılmasına ve bunun BO enteroid modeline kıyasla geçirgenliği nasıl etkileyebileceğine izin verir.
Introduction
Enteroidler, organ kısıtlı insan bağırsak kök hücrelerinden türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır 1,2. Tamamen epitel soyundan oluşurlar ve tüm farklılaşmış intestinal epitel hücre tipleriniiçerirler 2. Enteroidler ayrıca bir iç bölme oluşturan apikal bir luminal yüzeyden ve çevredeki ortama bakan bazolateral bir yüzeyden oluşan hücresel polariteyi korurlar. Enteroidler, üretildikleri konakçının özelliklerini korudukları için benzersiz bir modeldir3. Bu nedenle, prematüre insan bebeklerinden üretilen enteroidler, nekrotizan enterokolit (NEC) gibi öncelikle bu popülasyonu etkileyen hastalıkları araştırmak için yararlı olan bir modeli temsil eder.
Geleneksel enteroid model, enteroidin bir bazal membran matrisi (BMM) kubbesi içine alındığı bir bazolateral çıkış (BO) konformasyonunda yetiştirilir. BMM, enteroidin dışarıdaki bazolateral yüzey ile 3D bir yapıyı korumasını sağlar. BO enteroidleri, iki boyutlu (2D) birincil insan hücre hatları ile in vivo hayvan modelleri 2,4 arasındaki boşluğu dolduran NEC için uygun bir modeldir. NEC, enteroidleri çevreleyen ortama LPS veya bakteri gibi patojenlerin yerleştirilmesiyle enteroidlerde indüklenir, ardından hipoksik koşullara maruz kalır 2,3. BO enteroid NEC modeli ile ilgili zorluk, apikal yüzeyde in vivo olarak meydana gelen konakçı-patojen etkileşimlerinin etkili bir şekilde çalışılmasına izin vermemesidir. Bağırsak geçirgenliğindeki değişiklikler bu konakçı-patojen etkileşimlerinden kaynaklanmaktadır. Geçirgenliğin hastalığın patofizyolojik temelini nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için, apikal yüzeyin tedavisini içeren bir model oluşturulmalıdır.
Co ve ark., olgun BO enteroidlerinin, BMM kubbelerini çıkararak ve bunları medya5’te yeniden askıya alarak apikal-out (AO) konformasyonu oluşturmaya indüklenebileceğini gösteren ilk kişilerdir. Bu makalede, AO enteroidlerinin doğru epitel polaritesini koruduğu, tüm intestinal hücre tiplerini içerdiği, intestinal epitel bariyerini desteklediği ve apikal yüzeye erişime izin verdiğigösterilmiştir 5. AO enteroidlerinin bir NEC modeli olarak kullanılması, hastalık sürecinin fizyolojik bir üremesini ve konakçı-patojen etkileşimlerinin incelenmesini sağlar.
NEC’nin patofizyolojisine önemli bir katkıda bulunanlardan biri artmış bağırsak geçirgenliğidir6. İn vitro7 bağırsak geçirgenliğini test etmenin bir yolu olarak birkaç molekül önerilmiştir. Bunlar arasında, lusifer sarısı (LY), sırasıyla 428 nm ve 540 nm’de uyarma ve emisyon zirvelerine sahip hidrofilik bir boyadır. Tüm ana parasellüler yollardan geçerken, kan-beyin ve bağırsak epitel bariyerleri 8,9 dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için kullanılmıştır. LY’nin geleneksel uygulaması, yarı geçirgen bir yüzey10 üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücreleri kullanır. LY apikal yüzeye uygulanır ve bazolateral tarafta toplanmak için parasellüler sıkı bağlantı proteinlerinden geçer. Bazolateral bölmedeki daha yüksek LY konsantrasyonları, daha sonra bağırsak epitel hücre bariyeri parçalanması ve artan geçirgenlik10 ile birlikte sıkı bağlantı proteinlerinin azaldığını gösterir. Ayrıca, LY’nin medyaya eklendiği ve LY’nin lümen11’e alımı için bireysel enteroidlerin görüntülendiği 3D BO enteroid modellerinde de tanımlanmıştır. Bu, LY alımının görselleştirilmesi yoluyla nitel analize izin vermesine rağmen, nicel analiz sınırlıdır. Bu protokol, AO enteroidlerinde in vitro NEC enteroid modeli kullanarak parasellüler geçirgenliği değerlendirmek için LY kullanan ve 3D oryantasyonunu koruyan benzersiz bir tekniği özetlemektedir. Bu yöntem, geçirgenliğin hem kalitatif hem de nicel analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak geçirgenliği karmaşıktır ve epitel bariyer fonksiyonunu yansıtır. Bağırsak bariyeri, transsellüler ve parasellüler transporta aracılık eden tek bir epitel hücresi tabakasından oluşur14. Parasellüler geçirgenlik, epitel hücreleri arasındaki boşluğu kapatan sıkı bağlantı proteinlerine dayanır14. Bu parasellüler taşıma içinde, moleküllerin geçebileceği üç ayrı yol vardır: gözenek, sızıntı ve sınırsız15</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Rochester Üniversitesi Tıp Merkezi’nden Ashley Nelson’a enteroid modelimize verdiği araçsal yardım için teşekkür ederiz. Oklahoma Üniversitesi Çocuk Cerrahisi Bölümü’ne de bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Yetişkin Kök Hücre Araştırmaları Merkezi ve Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Cerrahi Bölümü’ne verilen Presbiteryen Sağlık Vakfı Hibe #20180587 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
