体内 啮齿动物膨胀诱发尿路上皮ATP释放的管腔测量
Summary
该协议描述了在麻醉啮齿动物中测量膀胱腔中ATP浓度的程序。
Abstract
ATP 因膀胱扩张而从尿路上皮释放，被认为在控制排尿中起显著的感觉作用。因此，在生理环境中准确测量尿路上皮ATP释放是研究控制膀胱嘌呤能信号传导机制的重要第一步。研究机械诱发尿路上皮ATP释放的现有技术利用接种在柔性支架上的培养细胞或固定在Ussing室中的膀胱组织;然而，这些技术中的每一种都不能完全模拟完整膀胱的状况。因此，开发了一种实验装置来直接测量啮齿动物膀胱管腔中的ATP浓度。
在这种设置中，麻醉啮齿动物的膀胱通过膀胱圆 顶和尿 道外口的导管灌注。通过盖住尿道导管，同时通过圆顶将无菌液体注入膀胱来增加膀胱中的压力。使用连接到膀胱圆顶导管的压力传感器实现膀胱内压力的测量，类似于用于膀胱测量的设置。一旦达到所需的压力，取下尿道导管的盖，并通过荧光素-荧光素酶测定收集液体用于ATP定量。通过这种实验装置，可以通过在灌注液中加入各种激动剂或拮抗剂或通过比较野生型和转基因动物之间的结果来询问控制尿路上皮ATP释放的机械和化学刺激的机制。
Introduction
尿 ATP 被认为在控制排尿中起显着的感觉作用1.例如，人们认为ATP从尿路上皮释放以响应膨胀，它可以作用于膀胱传入神经上的受体以增加其兴奋性，从而导致饱腹感2。因此，人们还认为尿ATP可能是膀胱病变发展的重要参与者。为了支持这一假设，患有膀胱过度活动症（OAB）3，膀胱疼痛综合征/间质性膀胱炎（BPS / IC）4或尿路感染（UTI）的患者的尿ATP浓度显着增加5，6，所有情况的特征都是增加的紧迫性，频率和有时疼痛。相反，患有膀胱活动不足（UAB）的患者，其特征是无法排空膀胱，有时可能包括感知膀胱充盈的能力下降，已被证明尿ATP浓度降低7。实验上，尿ATP浓度的操作可以改变大鼠的膀胱反射;通过阻断膀胱腔中的内源性ATP酶来增加ATP浓度可以增加排尿频率，而通过将外源性ATP酶注入膀胱来降低ATP浓度会降低排尿频率8。因此，尿ATP对膀胱功能的重要性是显而易见的。
鉴于尿ATP对膀胱病理学的明显重要性，准确测量尿路上皮ATP释放是了解控制释放机制的重要一步。许多研究已经使用不同的实验模型来完成测量尿路上皮ATP的释放。其中最重要的是细胞培养物，原代培养物或细胞系。然而，培养的尿路上皮细胞的使用很复杂，因为尿路上皮细胞不会呈现其生理极化形态，除非它们生长在特殊的可渗透膜上（例如Transwell技术[孔插入]）9。因此，很难将测量的任何ATP释放与生理学联系起来。在孔插入物上生长的尿路上皮细胞可以极化并形成类似于 体内看到的屏障;然而，完全分化的尿路上皮的生长可能需要数天或数周。此外，虽然可以将孔插入室安装到Ussing室中并向顶端侧施加压力以引起拉伸，但在病理期间很难施加足够的压力来模拟膀胱内的情况（即，压力为30cm H2O或以上）。整个膀胱组织也可以安装在Ussing室中进行拉伸实验，但这会将膀胱与维持尿路上皮细胞健康的营养因子一起从生物体中移除，从而维持尿路上皮屏障功能。因此，研究ATP响应拉伸或压力从尿路上皮释放的最生理相关方法是 体内。建立实验所需的手术技术与动物膀胱测量中常用的技术相同，因此，任何熟悉该技术的人都应该很容易进行。
在该协议中，我们将描述用于检查体重约200-250g的雌性Sprague Dawley大鼠管腔ATP的技术，因为下面描述的经尿道导管插入术在雌性中要容易得多;然而，经尿道导尿术也可以在雄性啮齿动物中进行10。由于经尿道导管插入术现在已经在两性小鼠中进行11，因此根据研究小组的需要，这些实验可以很容易地适用于小鼠或任何性别或不同大小的大鼠。
Protocol
Representative Results
Discussion
大多数关于尿路上皮ATP释放的研究都是在培养细胞中进行的，使用永生化细胞系或啮齿动物尿路上皮细胞的原代培养物。虽然这些模型具有相对高通量的优点（即，一次培养/传代可以制作许多细胞板/培养皿），但由于以下原因，它们的生理相关性降低：1）尿路上皮细胞无法生长极化，除非它们在特殊载体上生长，2）难以将培养的细胞暴露于生理水平的拉伸/压力。处理这些限制的一种方法是从?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）对JMB（DK117884）的资助。
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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