In vivo Mesure luminale de la libération d’ATP urothéliale évoquée par distension chez les rongeurs
Summary
Ce protocole décrit la procédure de mesure des concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie chez un rongeur anesthésié.
Abstract
On pense que l’ATP, libéré par l’urothélium en réponse à la distension de la vessie, joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction. Par conséquent, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale dans un contexte physiologique est une première étape importante dans l’étude des mécanismes qui contrôlent la signalisation purinergique dans la vessie. Les techniques existantes pour étudier la libération d’ATP urothéliale évoquée mécaniquement utilisent des cellules cultivées plaquées sur des supports flexibles ou des tissus vésicaux épinglés dans des chambres d’Ussing; Cependant, chacune de ces techniques n’imite pas complètement les conditions dans la vessie intacte. Par conséquent, une installation expérimentale a été développée pour mesurer directement les concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie des rongeurs.
Dans cette configuration, les vessies des rongeurs anesthésiés sont perfusées à travers des cathéters à la fois dans le dôme de la vessie et via l’orifice urétral externe. La pression dans la vessie est augmentée en coiffant le cathéter urétral tout en perfusant du liquide stérile dans la vessie à travers le dôme. La mesure de la pression intravésicale est réalisée à l’aide d’un transducteur de pression fixé au cathéter à dôme vésical, semblable à la configuration utilisée pour la cystométrie. Une fois la pression désirée atteinte, le capuchon du cathéter urétral est retiré et le liquide prélevé pour la quantification de l’ATP par dosage de la luciférine-luciférase. Grâce à cette configuration expérimentale, les mécanismes contrôlant à la fois la stimulation mécanique et chimique de la libération d’ATP urothéliale peuvent être interrogés en incluant divers agonistes ou antagonistes dans le perfusat ou en comparant les résultats entre les animaux de type sauvage et génétiquement modifiés.
Introduction
On pense que l’ATP urinaire joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction1. Par exemple, on pense que l’ATP est libéré de l’urothélium en réponse à la distension où il peut agir sur les récepteurs des nerfs afférents de la vessie pour augmenter leur excitabilité, conduisant à des sensations de plénitude2. Ainsi, on pense également que l’ATP urinaire pourrait être un acteur important dans le développement des pathologies de la vessie. À l’appui de cette hypothèse, les concentrations urinaires d’ATP sont significativement augmentées chez les patients souffrant d’hyperactivité vésicale (vessie hyperactive)3, de syndrome de douleur vésicale/cystite interstitielle (SPB/IC)4 ou d’infection des voies urinaires (IVU)5,6, toutes conditions caractérisées par une urgence, une fréquence et, parfois, une douleur accrues. À l’inverse, il a été démontré que les patients souffrant de vessie sous-active (UAB), qui se caractérise par une incapacité à vider sa vessie et peut parfois inclure une diminution de la capacité à sentir la plénitude de la vessie, ont diminué les concentrations urinairesd’ATP 7. Expérimentalement, la manipulation des concentrations urinaires d’ATP peut modifier les réflexes vésicaux chez le rat; l’augmentation des concentrations d’ATP en bloquant les ATPases endogènes dans la lumière de la vessie peut augmenter la fréquence de miction, tandis que la diminution des concentrations d’ATP en instillant des ATPases exogènes dans la vessie réduit la fréquence de miction8. Ainsi, l’importance de l’ATP urinaire pour la fonction de la vessie est claire.
Compte tenu de l’importance apparente de l’ATP urinaire pour la pathologie de la vessie, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale est une étape importante dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent la libération. De nombreuses études ont été réalisées en utilisant différents modèles expérimentaux pour mesurer la libération d’ATP urothéliale. Au premier rang d’entre eux sont les cultures cellulaires, soit des cultures primaires, soit des lignées cellulaires. Cependant, l’utilisation de cellules urothéliales en culture est compliquée par le fait que les cellules urothéliales ne prennent pas leur morphologie polarisée physiologique à moins qu’elles ne soient cultivées sur des membranes perméables spéciales (telles que la technologie Transwell [inserts de puits])9. Ainsi, il est difficile de relier une libération d’ATP mesurée à la physiologie. Les cellules urothéliales cultivées sur des inserts de puits peuvent se polariser et former une barrière semblable à ce que l’on voit in vivo; Cependant, la croissance d’un urothélium complètement différencié peut prendre des jours ou des semaines. De plus, bien qu’il soit possible de monter des inserts de puits dans une chambre d’Ussing et d’appliquer une pression sur le côté apical pour provoquer un étirement, il est difficile d’appliquer une pression suffisante pour imiter les conditions à l’intérieur de la vessie pendant la pathologie (c.-à-d. pressions de 30 cm H2O ou plus). Le tissu entier de la vessie peut également être monté dans une chambre d’Ussing pour des expériences d’étirement, mais cela élimine la vessie de l’organisme ainsi que les facteurs trophiques maintenant la santé des cellules urothéliales et, par conséquent, la fonction de barrière urothéliale. Par conséquent, la façon la plus physiologiquement pertinente d’étudier la libération d’ATP par l’urothélium en réponse à l’étirement ou à la pression est in vivo. Les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de l’expérience sont identiques à celles couramment utilisées en cystométrie animale et, par conséquent, devraient être facilement effectuées par toute personne familière avec cette technique.
Dans ce protocole, nous décrirons la technique utilisée pour examiner l’ATP luminal chez les rats Sprague Dawley femelles pesant environ 200-250 g, car le cathétérisme transurétral décrit ci-dessous est beaucoup plus facile chez les femelles; Cependant, le cathétérisme transurétral peut également être effectué chez les rongeurs mâles10. Comme le cathétérisme transurétral a maintenant été effectué chez des souris des deux sexes11, ces expériences peuvent facilement être adaptées à des souris ou des rats des deux sexes ou de tailles variables, selon les besoins de l’équipe de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La majorité des recherches sur la libération d’ATP urothéliale sont menées dans des cellules en culture, en utilisant soit des lignées cellulaires immortalisées, soit des cultures primaires de cellules urothéliales de rongeurs. Bien que ces modèles aient l’avantage d’avoir un débit relativement élevé (c.-à-d. qu’une culture ou un passage peut faire de nombreuses assiettes/boîtes de cellules), leur pertinence physiologique est diminuée en raison : 1) de l’incapacité des cellules urothéliales à s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) à JMB (DK117884).
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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