Vivo में कृन्तकों में डिस्टेंशन-इवोकेटेड यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का ल्यूमिनल माप
Summary
यह प्रोटोकॉल एक एनेस्थेटाइज्ड कृंतक में मूत्राशय के लुमेन में एटीपी सांद्रता को मापने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Abstract
मूत्राशय के विघटन के जवाब में यूरोथेलियम से जारी एटीपी को माइक्रोट्यूरियन के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण संवेदी भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। इसलिए, एक शारीरिक सेटिंग में यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का सटीक माप मूत्राशय में प्यूरीनर्जिक सिग्नलिंग को नियंत्रित करने वाले तंत्र का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। यांत्रिक रूप से उत्पन्न यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का अध्ययन करने के लिए मौजूदा तकनीकें लचीले समर्थन या मूत्राशय के ऊतकों पर चढ़ाई गई सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग करती हैं; हालांकि, इनमें से प्रत्येक तकनीक बरकरार मूत्राशय में स्थितियों का पूरी तरह से अनुकरण नहीं करती है। इसलिए, कृंतक मूत्राशय के लुमेन में एटीपी सांद्रता को सीधे मापने के लिए एक प्रयोगात्मक सेटअप विकसित किया गया था।
इस सेटअप में, एनेस्थेटाइज्ड कृन्तकों के मूत्राशय को मूत्राशय के गुंबद और बाहरी मूत्रमार्ग छिद्र दोनों में कैथेटर के माध्यम से संक्रमित किया जाता है। गुंबद के माध्यम से मूत्राशय में बाँझ तरल पदार्थ डालने के दौरान मूत्रमार्ग कैथेटर को कैप करके मूत्राशय में दबाव बढ़ जाता है। इंट्रावेसिक दबाव का माप मूत्राशय गुंबद कैथेटर से जुड़े दबाव ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो सिस्टोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले सेटअप के समान है। एक बार वांछित दबाव तक पहुंचने के बाद, मूत्रमार्ग कैथेटर की टोपी को हटा दिया जाता है, और ल्यूसिफेरिन-लूसिफेरस परख द्वारा एटीपी परिमाणीकरण के लिए तरल पदार्थ एकत्र किया जाता है। इस प्रयोगात्मक सेटअप के माध्यम से, यूरोथेलियल एटीपी रिलीज के यांत्रिक और रासायनिक उत्तेजना दोनों को नियंत्रित करने वाले तंत्र को विभिन्न एगोनिस्ट या विरोधी को पर्फ्यूसेट में शामिल करके या वाइल्डटाइप और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के बीच परिणामों की तुलना करके पूछताछ की जा सकती है।
Introduction
मूत्र एटीपी को माइक्रोट्यूरियन1 के नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण संवेदी भूमिका निभाने के लिए माना जाता है। उदाहरण के लिए, यह माना जाता है कि एटीपी को डिस्टेंशन के जवाब में यूरोथेलियम से जारी किया जाता है जहां यह मूत्राशय अभिवाही नसों पर रिसेप्टर्स पर उनकी उत्तेजना बढ़ाने के लिए कार्य कर सकता है, जिससे परिपूर्णता की संवेदनाएंहोती हैं। इस प्रकार, यह भी सोचा जाता है कि मूत्राशय की विकृति के विकास में मूत्र एटीपी एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी हो सकता है। इस परिकल्पना के समर्थन में, अतिसक्रिय मूत्राशय (ओएबी) 3, मूत्राशय दर्द सिंड्रोम / अंतरालीय सिस्टिटिस (बीपीएस / आईसी) 4, या मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) 5,6 से पीड़ित रोगियों में मूत्र एटीपी सांद्रता में काफी वृद्धि हुई है, सभी स्थितियां बढ़ी हुई तात्कालिकता, आवृत्ति और, कभी-कभी, दर्द की विशेषता है। इसके विपरीत, अंडरएक्टिव मूत्राशय (यूएबी) से पीड़ित रोगियों, जो किसी के मूत्राशय को खाली करने में असमर्थता की विशेषता है और कभी-कभी मूत्राशय की परिपूर्णता को समझने की क्षमता में कमी आ सकती है, को मूत्र एटीपी सांद्रता में कमी देखी गईहै। प्रयोगात्मक रूप से, मूत्र एटीपी सांद्रता का हेरफेर चूहे में मूत्राशय की सजगता को बदल सकता है; मूत्राशय लुमेन में अंतर्जात एटीपीस को अवरुद्ध करके एटीपी सांद्रता में वृद्धि शून्य आवृत्ति को बढ़ा सकती है, जबकि मूत्राशय में बहिर्जात एटीपीस डालकर एटीपी सांद्रता को कम करने से शून्य आवृत्तिकम हो जाती है। इस प्रकार, मूत्राशय समारोह के लिए मूत्र एटीपी का महत्व स्पष्ट है।
मूत्राशय विकृति के लिए मूत्र एटीपी के स्पष्ट महत्व को देखते हुए, यूरोथेलियल एटीपी रिलीज का सटीक माप रिलीज को नियंत्रित करने वाले तंत्र को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है। यूरोथेलियल एटीपी रिलीज को मापने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके कई अध्ययन पूरे किए गए हैं। इनमें से सबसे महत्वपूर्ण सेल संस्कृतियां हैं, या तो प्राथमिक संस्कृतियां या सेल लाइनें। हालांकि, सुसंस्कृत यूरोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग इस तथ्य से जटिल है कि यूरोथेलियल कोशिकाएं अपने शारीरिक ध्रुवीकृत आकृति विज्ञान को तब तक नहीं लेती हैं जब तक कि वे विशेष पारगम्य झिल्ली (जैसे ट्रांसवेल तकनीक [अच्छी तरह से सम्मिलित]) पर नहीं उगाई जाती हैं। इस प्रकार, शरीर विज्ञान से मापा गया किसी भी एटीपी रिलीज से संबंधित होना मुश्किल है। अच्छी तरह से डालने पर उगाई गई यूरोथेलियल कोशिकाएं ध्रुवीकरण कर सकती हैं और विवो में देखी जाने वाली बाधा बना सकती हैं; हालांकि, पूरी तरह से विभेदित यूरोथेलियम के विकास में दिन या सप्ताह लग सकते हैं। इसके अतिरिक्त, जबकि एक यूसिंग कक्ष में अच्छी तरह से सम्मिलित करना और खिंचाव पैदा करने के लिए एपिकल साइड पर दबाव लागू करना संभव है, पैथोलॉजी के दौरान मूत्राशय के अंदर स्थितियों की नकल करने के लिए पर्याप्त दबाव लागू करना मुश्किल है (यानी, 30 सेमी एच2ओ या उससे ऊपर का दबाव)। खिंचाव प्रयोगों के लिए पूरे मूत्राशय के ऊतकों को एक यूसिंग कक्ष में भी रखा जा सकता है, लेकिन यह मूत्राशय को मूत्राशय को यूरोथेलियल सेल स्वास्थ्य को बनाए रखने वाले ट्रॉफिक कारकों के साथ-साथ जीव से हटा देता है और इसलिए, यूरोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन। इसलिए, खिंचाव या दबाव के जवाब में यूरोथेलियम से एटीपी की रिहाई का अध्ययन करने का सबसे शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीका विवो में है। प्रयोग को स्थापित करने के लिए आवश्यक सर्जिकल तकनीक आमतौर पर पशु सिस्टोमेट्री में उपयोग की जाने वाली तकनीकों के समान हैं और इसलिए, उस तकनीक से परिचित किसी भी व्यक्ति द्वारा आसानी से किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में, हम लगभग 200-250 ग्राम वजन वाले मादा स्प्राग डॉवले चूहों में ल्यूमिनल एटीपी की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीक का वर्णन करेंगे, क्योंकि नीचे वर्णित ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन महिलाओं में बहुत आसान है; हालांकि, ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन नर कृन्तकों में भी किया जा सकता है। चूंकि ट्रांसयूरेथ्रल कैथीटेराइजेशन अब दोनों लिंगों के चूहों के साथ-साथ11 में भी किया गया है, इन प्रयोगों को अनुसंधान टीम की जरूरतों के आधार पर आसानी से चूहों या या तो लिंग या अलग-अलग आकार के चूहों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यूरोथेलियल एटीपी रिलीज में अधिकांश शोध सुसंस्कृत कोशिकाओं में आयोजित किया जाता है, या तो अमर सेल लाइनों या कृंतक यूरोथेलियल कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करके। जबकि इन मॉडलों में अपेक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) से जेएमबी (डीके 117884) को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
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