In vivo Luminal mätning av distension-framkallad urotelial ATP-frisättning hos gnagare

Summary

Detta protokoll beskriver proceduren för mätning av ATP-koncentrationer i blåsans lumen i en bedövad gnagare.

Abstract

ATP, frisatt från urotelet som svar på blåsans distension, tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering. Därför är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning i en fysiologisk miljö ett viktigt första steg för att studera mekanismerna som styr purinerg signalering i urinblåsan. Befintliga tekniker för att studera mekaniskt framkallad urotelial ATP-frisättning använder odlade celler pläterade på flexibla stöd eller blåsvävnad fäst i Ussing-kamrar; Var och en av dessa tekniker efterliknar emellertid inte helt förhållandena i den intakta blåsan. Därför utvecklades en experimentell inställning för att direkt mäta ATP-koncentrationer i lumen i gnagarens urinblåsa.

I denna inställning perfuseras blåsorna hos bedövade gnagare genom katetrar i både blåsans kupol och via den yttre urinrörsöppningen. Trycket i urinblåsan ökas genom att täcka urinrörskatetern medan den perfuserar steril vätska i blåsan genom kupolen. Mätning av intravesikalt tryck uppnås med hjälp av en tryckgivare fäst vid blåsans kupolkateter, liknande den inställning som används för cystometri. När önskat tryck har uppnåtts avlägsnas urinrörskateterns lock och vätska samlas upp för ATP-kvantifiering genom luciferin-luciferasanalys. Genom denna experimentella uppställning kan mekanismerna som styr både mekanisk och kemisk stimulering av urotelial ATP-frisättning undersökas genom att inkludera olika agonister eller antagonister i perfusatet eller genom att jämföra resultat mellan vildtyp och genetiskt modifierade djur.

Introduction

Urin ATP tros spela en betydande sensorisk roll i kontrollen av urinering¹. Till exempel är det tänkt att ATP frigörs från urotelet som svar på distension där det kan verka på receptorer på blåsans afferenta nerver för att öka deras excitabilitet, vilket leder till känslor av fullhet². Således är det också tänkt att urin ATP kan vara en viktig aktör i utvecklingen av blåspatologier. Till stöd för denna hypotes är ATP-koncentrationerna i urinen signifikant ökade hos patienter som lider av överaktiv blåsa (OAB)³, blåssmärtsyndrom/interstitiell cystit (BPS/IC)⁴ eller urinvägsinfektion (UTI)^5,6, alla tillstånd som kännetecknas av ökad brådska^, frekvens och ibland smärta. Omvänt har patienter som lider av underaktiv blåsa (UAB), som kännetecknas av en oförmåga att tömma blåsan och ibland kan inkludera en minskad förmåga att känna blåsans fullhet, visat sig ha minskade ATP-koncentrationer i urinen⁷. Experimentellt, manipulation av urin ATP-koncentrationer kan förändra urinblåsan reflexer i råtta; ökande ATP-koncentrationer genom att blockera endogena ATPaser i blåsans lumen kan öka tömningsfrekvensen, medan minskande ATP-koncentrationer genom att införa exogena ATPaser i urinblåsan minskar tömningsfrekvensen⁸. Således är betydelsen av urin ATP till blåsfunktionen tydlig.

Med tanke på den uppenbara betydelsen av urin ATP till urinblåsans patologi är noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning ett viktigt steg för att förstå de mekanismer som styr frisättning. Många studier har genomförts med olika experimentella modeller för att mäta urotelial ATP-frisättning. Främst bland dessa är cellkulturer, antingen primära kulturer eller cellinjer. Användningen av odlade urotelceller kompliceras emellertid av det faktum att urotelceller inte tar på sig sin fysiologiska polariserade morfologi om de inte odlas på speciella permeabla membran (såsom Transwell-teknik [brunnsinsatser])⁹. Således är det svårt att relatera någon ATP-frisättning uppmätt till fysiologi. Urotelceller odlade på brunnsinsatser kan polarisera och bilda en barriär som liknar vad som ses in vivo; Tillväxten av ett helt differentierat urotel kan emellertid ta dagar eller veckor. Dessutom, medan det är möjligt att montera brunnsinsatser i en Ussing-kammare och applicera tryck på den apikala sidan för att orsaka sträckning, är det svårt att applicera tillräckligt med tryck för att efterlikna förhållandena inuti blåsan under patologi (dvs tryck på 30 cm_H2Oeller högre). Hela blåsvävnaden kan också monteras i en Ussing-kammare för stretchexperiment, men detta tar bort blåsan från organismen tillsammans med de trofiska faktorerna som upprätthåller urotelcellhälsan och därmed urotelbarriärfunktionen. Därför är det mest fysiologiskt relevanta sättet att studera frisättningen av ATP från urotelet som svar på stretch eller tryck in vivo. De kirurgiska tekniker som behövs för att sätta upp experimentet är identiska med dem som vanligtvis används i djurcystometri och bör därför enkelt utföras av alla som är bekanta med den tekniken.

I detta protokoll kommer vi att beskriva tekniken som används för att undersöka luminal ATP hos kvinnliga Sprague Dawley-råttor som väger cirka 200-250 g, eftersom den transuretrala kateteriseringen som beskrivs nedan är mycket lättare hos kvinnor; Transuretral kateterisering kan emellertid också utföras hos manliga gnagare¹⁰. Eftersom transuretral kateterisering nu har utförts även hos möss av båda könen¹¹, kan dessa experiment enkelt anpassas för möss eller råttor av båda könen eller av varierande storlek, beroende på forskargruppens behov.

Protocol

Alla procedurer som utförs på gnagare måste följa gällande riktlinjer och godkännas av den lokala institutionella etikprövningskommittén. Experimenten som utfördes för detta manuskript utfördes i enlighet med National Research Council’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 för en modifierad version av standardinställningen för cystometri …

Representative Results

Det beskrivna protokollet möjliggör noggrann mätning av urotelial ATP-frisättning in vivo från blåsans lumen med användning av en modifierad version av standardinställningen för gnagarecystometri (se figur 1). Detta gör det möjligt för forskaren att undersöka effekterna av läkemedel på sträckmedierad ATP-frisättning i en fysiologisk miljö. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_uplo…

Discussion

Majoriteten av forskningen om urotelial ATP-frisättning utförs i odlade celler, med användning av antingen odödliga cellinjer eller primära kulturer av gnagare urotelceller. Medan dessa modeller har fördelen av att vara relativt hög genomströmning (dvs en kultur / passage kan göra många plattor / rätter av celler), minskar deras fysiologiska relevans på grund av: 1) urotelcellernas oförmåga att växa polariserade om de inte odlas på speciella stöd och 2) svårigheten att utsätta odlade celler för fysiol…

Materials

amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose