İn Vivo Kemirgenlerde Distansiyon Uyarılmış Ürotelyal ATP Salınımının Luminal Ölçümü
Summary
Bu protokol, anestezi uygulanan bir kemirgende mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını ölçme prosedürünü açıklar.
Abstract
Mesane distansiyonuna yanıt olarak ürotelyumdan salınan ATP’nin, işitasyonun kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle, ürotelyal ATP salınımının fizyolojik bir ortamda doğru ölçülmesi, idrar kesesinde pürinerjik sinyalleşmeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilk adımdır. Mekanik olarak uyarılmış ürotelyal ATP salınımını incelemek için mevcut teknikler, esnek destekler üzerine kaplanmış kültürlü hücreleri veya Ussing odalarına sabitlenmiş mesane dokusunu kullanır; Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri, sağlam mesanedeki koşulları tam olarak taklit etmez. Bu nedenle, kemirgen idrar kesesinin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için deneysel bir kurulum geliştirilmiştir.
Bu kurulumda, anestezi uygulanan kemirgenlerin mesaneleri, hem mesanenin kubbesindeki kateterlerden hem de dış üretral delikten geçirilir. Mesanedeki basınç, üretral kateterin kapatılmasıyla arttırılırken, steril sıvının kubbe yoluyla mesaneye nüfuz ettirilmesiyle arttırılır. İntravezikal basıncın ölçümü, sistometri için kullanılan kuruluma benzer şekilde, mesane kubbe kateterine bağlı bir basınç transdüseri kullanılarak gerçekleştirilir. İstenilen basınca ulaşıldıktan sonra, üretral kateter kapağı çıkarılır ve lusiferin-lusiferaz testi ile ATP nicelleştirmesi için sıvı toplanır. Bu deney düzeneği sayesinde, ürotelyal ATP salınımının hem mekanik hem de kimyasal stimülasyonunu kontrol eden mekanizmalar, perfüzyona çeşitli agonistler veya antagonistler dahil edilerek veya vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar arasındaki sonuçlar karşılaştırılarak sorgulanabilir.
Introduction
Üriner ATP’nin miksiyonkontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir 1. Örneğin, ATP’nin, uyarılabilirliklerini arttırmak için mesane afferent sinirleri üzerindeki reseptörler üzerinde hareket edebileceği ve dolgunluk hissine yol açabileceği distansiyona yanıt olarak ürotelyumdan salındığı düşünülmektedir2. Bu nedenle, idrar ATP’sinin mesane patolojilerinin gelişiminde önemli bir oyuncu olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi desteklemek için, aşırı aktif mesane (OAB)3, mesane ağrısı sendromu/interstisyel sistit (BPS/IC)4 veya idrar yolu enfeksiyonu (İYE)5,6 şikayeti olan hastalarda, artan aciliyet, sıklık ve bazen ağrı ile karakterize tüm durumlarda, üriner ATP konsantrasyonları anlamlı olarak artmıştır. Tersine, mesanesini boşaltamamakla karakterize olan ve bazen mesane dolgunluğunu algılama yeteneğinin azalmasını içerebilen düşük aktif mesaneden (UAB) muzdarip hastaların, idrar ATP konsantrasyonlarının azaldığı gösterilmiştir7. Deneysel olarak, idrar ATP konsantrasyonlarının manipülasyonu sıçandaki mesane reflekslerini değiştirebilir; Mesane lümenindeki endojen ATPazları bloke ederek ATP konsantrasyonlarının arttırılması işeme sıklığını artırabilirken, mesaneye eksojen ATPazlar aşılayarak ATP konsantrasyonlarını azaltmak işeme sıklığını azaltır8. Bu nedenle, idrar ATP’sinin mesane fonksiyonu için önemi açıktır.
Üriner ATP’nin mesane patolojisi için belirgin önemi göz önüne alındığında, ürotelyal ATP salınımının doğru ölçülmesi, salınımı kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir adımdır. Ürotelyal ATP salınımını ölçmek için farklı deneysel modeller kullanılarak birçok çalışma tamamlanmıştır. Bunların başında hücre kültürleri, birincil kültürler veya hücre hatları gelir. Bununla birlikte, kültürlenmiş ürotelyal hücrelerin kullanımı, ürotelyal hücrelerin özel geçirgen membranlarda (Transwell teknolojisi [kuyu ekleri] gibi) yetiştirilmedikçe fizyolojik polarize morfolojilerini üstlenmemeleri nedeniyle karmaşıktır9. Bu nedenle, ölçülen herhangi bir ATP salınımını fizyoloji ile ilişkilendirmek zordur. Kuyu uçlarında yetişen ürotelyal hücreler polarize olabilir ve in vivo görülene benzer bir bariyer oluşturabilir; Bununla birlikte, tamamen farklılaşmış bir ürotelyumun büyümesi günler veya haftalar sürebilir. Ek olarak, kuyu uçlarını bir Ussing odasına monte etmek ve gerilmeye neden olmak için apikal tarafa basınç uygulamak mümkün olsa da, patoloji sırasında mesanenin içindeki koşulları taklit etmek için yeterli basınç uygulamak zordur (yani, 30 cmH2O veya üzeri basınçlar). Tüm mesane dokusu, streç deneyleri için bir Ussing odasına da monte edilebilir, ancak bu, ürotelyal hücre sağlığını ve dolayısıyla ürotelyal bariyer fonksiyonunu koruyan trofik faktörlerle birlikte mesaneyi organizmadan uzaklaştırır. Bu nedenle, gerilme veya basınca yanıt olarak ürotelyumdan ATP salınımını incelemenin fizyolojik olarak en alakalı yolu in vivo’dur. Deneyi kurmak için gereken cerrahi teknikler, hayvan sistometrisinde yaygın olarak kullanılanlarla aynıdır ve bu nedenle, bu tekniğe aşina olan herkes tarafından kolayca uygulanmalıdır.
Bu protokolde, yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki dişi Sprague Dawley sıçanlarında luminal ATP’yi incelemek için kullanılan tekniği açıklayacağız, çünkü aşağıda açıklanan transüretral kateterizasyon kadınlarda çok daha kolaydır; Bununla birlikte, transüretral kateterizasyon erkek kemirgenlerde de yapılabilir10. Transüretral kateterizasyon artık her iki cinsiyetteki farelerde de11 yapıldığından, bu deneyler araştırma ekibinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, cinsiyetteki veya farklı boyutlardaki fareler veya sıçanlar için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ürotelyal ATP salınımı ile ilgili araştırmaların çoğu, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veya kemirgen ürotelyal hücrelerinin birincil kültürleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirilir. Bu modeller nispeten yüksek verim avantajına sahip olsa da (yani, bir kültür / pasaj birçok tabak / hücre tabağı yapabilir), fizyolojik alaka düzeyleri şunlardan dolayı azalır: 1) ürotelyal hücrelerin özel destekler üzerinde yetiştirilmedikçe polarize büyüyememesi ve 2) kültür…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü’nden (NIDDK) JMB’ye (DK117884) verilen bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| amplifier | World Precision Instruments (WPI) | SYS-TBM4M | |
| ATP assay kit | Sigma-Aldrich, Inc. | FLAA-1KT | |
| data acquisition system/ software | DataQ Instruments | DI-1100 | Software included, requires Windows-based computer |
| Hexamethonium bromide | Sigma-Aldrich, Inc. | H0879 | 20 mg/kg dose |
| Isoflurane | Covetrus North America | 29404 | |
| lidocaine | Covetrus North America | 2468 | |
| Luer Lock plugs | Fisher Scientific | NC0455253 | |
| luminometer (GloMax 20/20) | Promega | E5311 | |
| Polyethylene (PE50) tubing | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| Pump 33 DDS syringe pump | Harvard Apparatus | 703333 | |
| pressure transducers | World Precision Instruments (WPI) | BLPR2 | |
| surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.) | Fine Science Tools | multiple numbers | |
| surgical lubricant | Fisher Scientific | 10-000-694 | |
| Sur-Vet I.V. catheter | Covetrus North America | 50603 | 20 G x 1 inch |
| tiltable surgical table (Plas Labs) | Fisher Scientific | 01-288-30A | |
| Tubing connectors | Fisher Scientific | 14-826-19E | allows Luer-Lock connectors to attach to tubing |
| Urethane | Sigma-Aldrich, Inc. | U2500 | 0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose |
References
- Burnstock, G. Purinergic signalling in the urinary tract in health and disease. Purinergic Signalling. 10 (1), 103-155 (2014).
- Birder, L. A. Urothelial signaling. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 33-40 (2010).
- Silva-Ramos, M., et al. Urinary ATP may be a dynamic biomarker of detrusor overactivity in women with overactive bladder syndrome. PLoS One. 8 (5), 64696 (2013).
- Sun, Y., Chai, T. C. Augmented extracellular ATP signaling in bladder urothelial cells from patients with interstitial cystitis. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 290 (1), 27-34 (2006).
- Gill, K., et al. Urinary ATP as an indicator of infection and inflammation of the urinary tract in patients with lower urinary tract symptoms. BMC Urology. 15 (1), 7 (2015).
- Säve, S., Persson, K. Extracellular ATP and P2Y receptor activation induce a proinflammatory host response in the human urinary tract. Infection and Immunity. 78 (8), 3609-3615 (2010).
- Munoz, A., Smith, C. P., Boone, T. B., Somogyi, G. T. Overactive and underactive bladder dysfunction is reflected by alterations in urothelial ATP and NO release. Neurochemistry International. 58 (3), 295-300 (2011).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. The Journal of Physiology. 593 (8), 1857-1871 (2015).
- Zhang, Y. Y., Ludwikowski, B., Hurst, R., Frey, P. Expansion and long-term culture of differentiated normal rat urothelial cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 37 (7), 419-429 (2001).
- Lee, S., Carrasco, A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral instillation procedure in adult male mouse. Journal of Visualized Experiments. (129), e56663 (2017).
- Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary tract infection in a small animal model: Transurethral catheterization of male and female mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. Journal of Visualized Experiments. (66), e3869 (2012).
- Leitao, J. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly luciferase inhibition. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 101 (1), 1-8 (2010).
- Auld, D. S., Thorne, N., Nguyen, D. T., Inglese, J. A specific mechanism for nonspecific activation in reporter-gene assays. ACS Chemical Biology. 3 (8), 463-470 (2008).
- Harvey, E. N. Studies on the oxidation of luciferin without luciferase and the mechanism of bioluminescence. Journal of Biological Chemistry. 78 (2), 369-375 (1928).
- Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. The food dye FD&C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1. The Journal of General Physiology. 141 (5), 649-656 (2013).
- Avazpour, M., Shiri, S., Delpisheh, A., Abbasi, A. M. Simultaneous determination of brilliant blue FCF and carmoisine in food samples by aqueous two-phase system and spectrophometric detection. Journal of Basic Research in Medical Sciences. 1 (1), 56-65 (2014).
