In vivo Luminal måling av distensjon-fremkalt urotelial ATP-frigjøring hos gnagere

Summary

Denne protokollen beskriver prosedyren for å måle ATP-konsentrasjoner i blærens lumen i en bedøvet gnager.

Abstract

ATP, frigjort fra urotelet som respons på blæredistensjon, antas å spille en betydelig sensorisk rolle i kontrollen av vannlating. Derfor er nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring i en fysiologisk setting et viktig første skritt i å studere mekanismene som styrer purinerg signalering i urinblæren. Eksisterende teknikker for å studere mekanisk fremkalt urotelial ATP-frigjøring benytter dyrkede celler belagt på fleksible støtter eller blærevev festet i Ussing-kamre; Imidlertid etterligner hver av disse teknikkene ikke fullt ut forholdene i den intakte blæren. Derfor ble det utviklet et eksperimentelt oppsett for direkte å måle ATP-konsentrasjoner i lumen i urinblæren hos gnagere.

I dette oppsettet blir blærene til bedøvede gnagere perfusert gjennom katetre i både blærekuppelen og via den eksterne urinrøråpningen. Trykket i blæren økes ved å kappe urinrørskateteret mens du perfuserer steril væske inn i blæren gjennom kuppelen. Måling av intravesikalt trykk oppnås ved hjelp av en trykktransduser festet til blærekuppelkateteret, beslektet med oppsettet som brukes til cystometri. Når ønsket trykk er nådd, fjernes urinkateterets hette, og væske oppsamles for ATP-kvantifisering ved luciferin-luciferase-analyse. Gjennom dette eksperimentelle oppsettet kan mekanismene som styrer både mekanisk og kjemisk stimulering av urotelial ATP-frigjøring undersøkes ved å inkludere forskjellige agonister eller antagonister i perfusatet eller ved å sammenligne resultater mellom villtype og genetisk modifiserte dyr.

Introduction

ATP i urin antas å spille en betydelig sensorisk rolle i kontrollen av vannlating¹. For eksempel antas det at ATP frigjøres fra urotelet som respons på distensjon der det kan virke på reseptorer på blæreafferente nerver for å øke spenningen, noe som fører til følelser av fylde². Dermed er det også antatt at urin ATP kan være en viktig aktør i utviklingen av blærepatologier. Til støtte for denne hypotesen er ATP-konsentrasjonene i urin signifikant økt hos pasienter som lider av overaktiv blære (OAB)³, blæresmertesyndrom/interstitiell cystitt (BPS/IC)⁴ eller urinveisinfeksjon (UVI)^5,6, alle tilstander karakterisert ved økt haster^, frekvens og noen ganger smerter. Omvendt, pasienter som lider av underaktiv blære (UAB), som er preget av en manglende evne til å tømme ens blære og kan noen ganger inkludere en redusert evne til å føle blæren fylde, har vist seg å ha redusert urin ATP konsentrasjoner⁷. Eksperimentelt kan manipulering av ATP-konsentrasjoner i urin endre blærereflekser hos rotter; økende ATP-konsentrasjoner ved å blokkere endogene ATPaser i blærelumen kan øke tømmingsfrekvensen, mens reduksjon av ATP-konsentrasjoner ved å sette inn eksogene ATPaser i blæren reduserer tømmingsfrekvensen⁸. Dermed er viktigheten av urin ATP til blærefunksjon klar.

Gitt den tilsynelatende betydningen av urin ATP til blærepatologi, er nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring et viktig skritt i å forstå mekanismene som kontrollerer frigjøring. Mange studier har blitt gjennomført ved hjelp av forskjellige eksperimentelle modeller for å måle urotelial ATP-frigjøring. Fremst blant disse er cellekulturer, enten primære kulturer eller cellelinjer. Imidlertid kompliseres bruken av dyrkede urotelceller av det faktum at urotelceller ikke tar på seg sin fysiologiske polariserte morfologi med mindre de dyrkes på spesielle permeable membraner (som Transwell-teknologi [brønninnsatser])⁹. Dermed er det vanskelig å relatere noen ATP-frigjøring målt til fysiologi. Urotelceller dyrket på brønninnsatser kan polarisere og danne en barriere som ligner på det som ses in vivo; Imidlertid kan veksten av et fullt differensiert urotel ta dager eller uker. I tillegg, mens det er mulig å montere brønninnlegg i et Ussing-kammer og legge trykk på den apikale siden for å forårsake strekk, er det vanskelig å påføre nok trykk for å etterligne forholdene i blæren under patologi (dvs. trykk på 30 cm H₂O eller høyere). Hele blærevevet kan også monteres i et Ussing-kammer for strekkeksperimenter, men dette fjerner blæren fra organismen sammen med de trofiske faktorene som opprettholder urotelcellehelsen og dermed urotelbarrierefunksjonen. Derfor er den mest fysiologisk relevante måten å studere frigjøring av ATP fra urotelet som respons på strekk eller trykk, in vivo. De kirurgiske teknikkene som trengs for å sette opp eksperimentet, er identiske med de som vanligvis brukes i cystometri hos dyr, og bør derfor enkelt utføres av alle som er kjent med den teknikken.

I denne protokollen vil vi beskrive teknikken som brukes til å undersøke luminal ATP hos kvinnelige Sprague Dawley-rotter som veier ca. 200-250 g, da transuretral kateterisering beskrevet nedenfor er mye lettere hos kvinner; Imidlertid kan transuretral kateterisering også utføres hos mannlige gnagere¹⁰. Siden transuretral kateterisering nå er utført hos mus av begge kjønn også¹¹, kan disse forsøkene enkelt tilpasses mus eller rotter av begge kjønn eller av varierende størrelse, avhengig av forskerteamets behov.

Protocol

Alle prosedyrer som utføres hos gnagere må følge gjeldende retningslinjer og godkjennes av den lokale institusjonelle etiske vurderingskomiteen. Forsøkene som ble utført for dette manuskriptet ble utført i samsvar med National Research Council’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Pittsburgh School of Medicine. Se figur 1 for en modifisert versjon av standard cystometrioppsett for gnagere …

Representative Results

Den beskrevne protokollen tillater nøyaktig måling av urotelial ATP-frigjøring in vivo fra blærens lumen, ved bruk av en modifisert versjon av standard cystometrioppsett for gnagere (se figur 1). Dette gjør det mulig for forskeren å undersøke effekten av legemidler på strekkmediert ATP-frigjøring i en fysiologisk setting. <b…

Discussion

Flertallet av forskningen på urotelial ATP-frigjøring utføres i dyrkede celler, ved bruk av enten immortaliserte cellelinjer eller primære kulturer av gnagere urotelceller. Selv om disse modellene har fordelen av å være relativt høy gjennomstrømning (dvs. en kultur / passasje kan lage mange plater / tallerkener av celler), blir deres fysiologiske relevans redusert på grunn av: 1) urotelcellers manglende evne til å vokse polarisert med mindre de dyrkes på spesielle støtter og 2) vanskeligheten med å utsette d…

Materials

amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose