제브라피시는 최근 잠재적인 방사선 조절제를 검증하기 위한 모델로 활용되고 있습니다. 본 프로토콜은 방사선 기반 스크리닝 실험에 제브라피시 배아를 사용하는 세부 단계와 다양한 처리 및 방사선의 효과를 평가하기 위한 몇 가지 관찰 접근 방식을 설명합니다.
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방법 논문
잠재적인 방사능 감작제 또는 보호제를 평가하기 위한 모델로서의 제브라피시 유충
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
제브라피쉬는 쉽게 관리할 수 있는 척추동물 모델 중 하나이며 독특하고 편리한 모델 시스템의 여러 기능을 보여주기 때문에 여러 종류의 연구에서 광범위하게 사용됩니다. 증식성이 높은 세포는 방사선으로 인한 DNA 손상에 더 취약하기 때문에 제브라피시 배아는 방사선 연구의 최전선 생체 내 모델입니다. 또한 이 모델은 주요 생물학적 사건 및 관련 반응과 함께 짧은 시간 내에 방사선 및 다양한 약물의 영향을 예측합니다. 여러 암 연구에서 제브라피시를 사용했으며, 이 프로토콜은 방사선 요법 및 암의 맥락에서 방사선 조절제의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법은 방사선 조사 및 대조군(비방사선 조사) 배아에 대한 다양한 약물의 효과를 검증하는 데 쉽게 사용할 수 있으므로 약물을 방사선 감작 또는 보호 약물로 식별할 수 있습니다. 이 방법론은 대부분의 약물 스크리닝 실험에 사용되지만 X선 방사선 노출을 배경으로 한 실험 및 독성 평가의 세부 사항이 제한적이거나 간략하게만 다루어져 수행이 어렵습니다. 이 프로토콜은 이 문제를 해결하고 자세한 그림과 함께 절차 및 독성 평가에 대해 설명합니다. 이 절차는 방사선 연구 및 방사선 기반 약물 스크리닝에 제브라피시 배아를 사용하여 신뢰성과 재현성을 높이는 간단한 접근 방식을 설명합니다.
서론
제브라피시(Danio rerio)는 지난 30년 동안 연구에 널리 사용되어 온 잘 알려진 동물 모델입니다. 실험실 조건에서 사육 및 번식하기 쉬운 작은 민물고기입니다. 제브라피쉬는 다양한 발달 및 독성 연구에 광범위하게 사용되어 왔다 1,2,3,4,5,6,7,8. 제브라피쉬는 번식력이 높고 배아 생성이 짧습니다. 배아는 다양한 발달 단계를 추적하는데 적합하고, 시각적으로 투명하며, 다양한 유전자 조작 및 고처리량 스크리닝 플랫폼 9,10,11,12,13,14에 적응할 수 있다.....
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프로토콜
본 연구는 부바네스와르 생명과학연구소 기관동물윤리위원회(Institutional Animal Ethical Committee)의 사전 승인과 지침에 따라 수행되었다. 모든 제브라피시 유지 및 번식은 28.5°C의 주변 어류 배양 시설에서 수행되었으며, 배아는 28.5°C의 생물학적 산소 요구량(BOD) 인큐베이터에서 유지되었습니다. 여기서, 제브라피시 AB 균주를 사용하였고, Kimmel et al.54에 따라 병기를 수행하였다. X선 방사선은 6hpf(차폐 단계)에서 주어졌으며 120hpf까지 다른 표현형을 관찰했습니다.
1. 번식 설정 및 배아 채취
- 번식 탱크를 설정합니다 (폴리 카보네이트로 구성, 용량 1L, 재료 표 참조). 시스템 용수(pH, 6.8-7.5, 전도도, 500μS, 온도 28.5°C)를 부피의 거의 40%를 차지하는 사육 탱크에 붓습니다. 탱크에 칸막이를 놓아 암컷과 수컷을 위한 두 개의 방을 만듭니다.
- 부모 탱크에서 그물을 사용하여 건강한 암컷 2 마리와 건강한 수컷 1 마리를 조심스럽게 모아 각각의 반쪽에 넣고 28.5 ° C에서 밤새 (최소 10 시간) 어둠 속에 보관하십시오....
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결과
프로토콜의 전체 레이아웃은 그림 2에 나와 있습니다. 방사선의 영향 및 선량에 따른 특성화는 다음과 같은 분석을 통해 평가되었습니다.
X선 유도 독성 평가
실체현미경을 사용하여 약물 처리 및/또는 방사선 치료 후 다음과 같은 이상을 평가하고 특성화했습니다. OECD 가이드라인 61에 따르면, 어류의 독성 평가를 위해 배아의 응고, 소마이트 형성의 기형, 난황낭에서 꼬리의 비분리, 심장 박동의 감소 또는 부재 등 4가지 주요 정점 평가변수를 포함하여 전체 독성을 분석했다61. 급성 독성은 위의 이상 중 하나에서 양성 결과를 기반으로 결정되었습니다. 이 4가지 주요 종점 외에도 척추 또는 꼬리 구부리기, 머리 기형 및 소두증, 발달 결함, 심낭 부종, 난황낭 기형, 수영 방광 기.......
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토론
제브라피시는 여러 유형의 암 연구를 포함한 많은 연구에서 귀중한 모델로 사용됩니다. 이 모델은 대규모 약물 스크리닝(67,68)을 위한 유용한 플랫폼을 제공한다. 다른 독성 평가 방법과 마찬가지로 방사선 및/또는 약물 처리 시 주요 생물학적 변화에 대한 정량적 평가는 이 프로토콜의 가장 중요한 부분입니다. 이러한 종류의 연구에서 생존이 독성을 관찰하는 유일한 기준이 되어서는 안 됩니다. 적절한 채점 시스템에 의한 신체적 또는 발달적 결함 평가가 뒷받침되어야 합니다. 이 경우에도 최대 72hpf까지 배아의 생존율은 배아가 5GY, 10GY 및 20GY의 X선 방사선량에 노출된 그룹 간에 크게 다르지 않습니다. 그러나 이러한 특정 용량에서 배아의 전반적인 형태 및 표현형을 확인하면 X선 독성이 생존 그래프를 통해 나타나는 것보다 더 심각하다는 것이 분명합니다. 이러한 용량에서 배아의 형태학적 기형의 심각성은 매우 높으며, 이는 .......
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공개 사항
저자들은 상충되는 이해관계가 없다고 선언했다.
감사의 글
SS의 연구실과 RKS의 연구실은 DBT와 인도의 SERB로부터 보조금을 지원받고 있습니다. APM은 인도 정부의 ICMR 펠로우십 수혜자입니다. DP는 인도 정부의 CSIR 펠로우십 수혜자입니다. UN은 인도 정부의 DST-Inspire 펠로우십 수혜자입니다. 그림 2 는 Biorender(https://biorender.com)를 사용하여 생성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 6 웰 플레이트 | Corning | CLS3335 | 폴리스티렌 |
| BOD 인큐베이터 | Oswald | JRIC-10 | |
| 염화칼슘 | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| 해부 현미경 | Zeiss | Stemi 2000 | |
| 1.0 L 사육 탱크 | Tecniplast | ZB10BTE | 폴리 카보네이 |
| 트 용 외부 탱크유리 페트리플레이트 | Borosil | 3165A75 | 유리 |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | 버전 5.01 | |
| Kline 오목한 슬라이드 | Himedia | GW092-1PK | 유리 |
| 염화마그네슘 | 시그마-알드리치 | M8266 | |
| 메틸렌 블루 하이드레이트 | 시그마-알드리치 | 66720-100G | |
| 파라필름 | 타르손스 | 380020 | 파라핀 필름 |
| 파스퇴르 피펫 | Himedia | PW1212-1X500NO | 폴리에틸렌 |
| 1.0L 사육 탱크 | Tecniplast | ZB10BTI | 폴리 카보네이 |
| 카보네이트 분배기 1.0L 사육 탱크 | Tecniplast | ZB10BTD | 폴리 카보네이 |
| 폴리 카보네이트 뚜껑 1.0L 사육 탱크 | Tecniplast | ZB10BTL | 폴리 카보네이 |
| 염화 칼 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| 수산화나트륨 펠릿 | SRL | 1949181 | |
| 실체 현미경 Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 정밀 X선 | 정밀 X-Ray | X-RAD 225XL |
참고문헌
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal
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재인쇄 및 허가
