인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양
Summary
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.
Abstract
신경퇴행성 장애는 증상과 세포 영향 측면에서 흔하고 이질적이어서 인간 질병을 완전히 모방하는 적절한 동물 모델이 부족하고 사후 인간 뇌 조직의 가용성이 낮기 때문에 연구가 복잡합니다. 성인 인간 신경 조직 배양은 신경 장애의 다양한 측면을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 분자, 세포 및 생화학적 메커니즘은 이 시스템에서 쉽게 해결할 수 있을 뿐만 아니라 약물 또는 세포 기반 요법과 같은 다양한 치료법을 테스트하고 검증할 수 있습니다. 이 방법은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻은 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양과 유도만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 이식을 결합합니다. 이 방법을 사용하면 세포 생존, 신경 분화, 시냅스 입력 및 출력 형성, 손상되지 않은 성인 인간 피질 조직에 이식한 후 인간 유래 세포의 전기생리학적 특성을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 다양한 신경 질환 환자를 위한 줄기 세포 기반 치료법의 임상 번역에 더 가까운 기초 연구를 제공하고 손상된 신경 회로를 재구성하기 위한 새로운 도구의 개발을 가능하게 하는 3D 인간 질병 모델링 플랫폼을 개발하기 전에 중요한 단계입니다.
Introduction
파킨슨병, 알츠하이머병 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 장애는 신경 기능 장애 또는 사망의 공통된 특징을 공유하는 질병 그룹입니다. 그들은 영향을받는 뇌 영역과 신경 집단 측면에서 이질적입니다. 불행하게도, 이러한 질병에 대한 치료법은 인간의 뇌에서 일어나는 것을 모방하는 동물 모델이 없기 때문에 드물거나 효능이 제한적이다 1,2. 줄기세포 치료는 뇌 재생을 위한 가장 유망한 전략 중 하나이다3. 다른 출처의 줄기 세포에서 신경 전구 세포의 생성은 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다 4,5. 최근 간행물에 따르면 인간 유도 만능 줄기(iPS) 세포 유래 장기 자가 재생 신경상피 유사 줄기(lt-NES) 세포는 피질 분화 프로토콜에 따라 체성 감각 피질에 영향을 미치는 허혈성 뇌졸중이 있는 쥐 모델에서 피질 내 이식 후 성숙한 피질 뉴런을 생성합니다. 또한, 이식편 유래 뉴런은 숙주 뉴런으로부터 구 심성 및 원심성 시냅스 연결을 받아 쥐 뉴런 네트워크 6,7에 통합되었음을 보여줍니다. 이식편 유래 축삭은 수초화되어 경색 주위 영역, 뇌량 및 반대쪽 체성 감각 피질을 포함하여 쥐 뇌의 다른 영역에서 발견되었습니다. 가장 중요한 것은 iPS 세포 유래 이식이 뇌졸중 동물의 운동 장애를 역전시켰다는 것이다 7.
동물 모델이 이식 생존, 신경 통합, 이식된 세포가 운동 및 인지 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 되더라도 인간 세포(이식편-숙주) 간의 상호 작용에 대한 정보는 이 시스템에서 누락되어 있습니다 8,9. 이러한 이유로, 인간 iPS 세포 유래 뉴런 전구체의 생체 외 이식과 함께 장기 인간 뇌 기관형 배양의 조합 방법이 여기에 기재되어 있다. 신경외과적 절제술을 통해 얻은 인간 뇌 기관형 배양은 생리학적으로 관련된 뇌의 3D 모델로, 연구자들이 인간 중추 신경계 회로에 대한 이해와 인간 뇌 질환 치료법을 테스트하는 가장 정확한 방법을 높일 수 있습니다. 그러나 이러한 맥락에서 충분한 연구가 이루어지지 않았으며, 대부분의 경우 인간 해마 뇌 기관형 배양이 사용되었습니다10,11. 대뇌 피질은 허혈성 뇌졸중12 또는 알츠하이머 병13과 같은 여러 신경 퇴행성 질환의 영향을 받기 때문에 지식을 넓히고 다양한 치료 전략을 테스트하고 검증 할 수있는 인간 피질 3D 시스템을 갖는 것이 중요합니다. 지난 몇 년 동안 여러 연구에서 성인 인간 피질(hACtx) 조직의 배양을 사용하여 인간 뇌 질환을 모델링했습니다 14,15,16,17,18,19; 그러나 줄기 세포 치료의 맥락에서 제한된 정보를 사용할 수 있습니다. 두 가지 연구가 이미 여기에 설명 된 시스템의 타당성을 입증했습니다. 2018년, 다양한 전사 인자로 프로그래밍되고 hACtx 조직에 이식된 인간 배아 줄기 세포는 성인 인간 피질 네트워크에 통합될 수 있는 성숙한 피질 뉴런을 생성하는 것으로 나타났습니다20. 2020년에 lt-NES 세포를 인간 기관형 시스템에 이식한 결과 기능적 뉴런의 전기생리학적 특성을 가진 성숙한 층별 피질 뉴런으로 분화할 수 있는 능력이 밝혀졌습니다. 이식된 뉴런은 성인 뇌 절편에서 인간 피질 뉴런과 구심성 및 원심성 시냅스 접촉을 모두 확립했으며, 이는 광견병 바이러스 역행 단시냅스 추적, 전체 세포 패치 클램프 기록 및 면역 전자 현미경에 의해 확증되었습니다21.
Protocol
이 프로토콜은 스웨덴 룬드에 있는 지역 윤리 위원회(윤리 허가 번호 2021-07006-01)에서 승인한 지침을 따릅니다. 건강한 신피질 조직은 측두엽 간질에 대한 선택적 수술을 받는 환자로부터 얻었습니다. 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 참고: 얻은 모든 조직은 크기에 관계없이 처리되었습니다. 그러나 크기가 1-1.5mm3보다 작은 조직은 기술적으로 다루?…
Representative Results
기술된 프로토콜에 따라, 측두엽 간질이 있는 환자로부터의 hACtx 조직을 상기 설명된 바와 같이 수집 및 처리하였다. 몇 개의 슬라이스를 숙주 조직의 시작점을 연구하기 위해 배양 24시간 후에 고정시켰다. 뉴런(NeuN 및 Map2 발현, 그림 1A), 희소돌기아교세포(Olig2 및 MBP, 그림 1B) 및 성상교세포(인간 특이적 GFAP, STEM123이라고도 함, 그림 1C)와 같은 다양한 신경 세포 집단을 분석<st…
Discussion
충분히 높은 품질의 hACtx 슬라이스를 얻는 것이 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 피질 조직은 절제 수술을 받는 간질 환자로부터 얻어진다24. 절제된 조직의 품질과 절제와 배양 사이의 조직 노출 시간은 매우 중요합니다. 조직이 수술실에서 실험실로 더 빨리 옮겨지고 절단될수록 기관형 배양이 더 최적화됩니다. 이상적으로는 조직을 절단하여 수집 후 처…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council), 스웨덴 뇌 재단(Swedish Brain Foundation), 스웨덴 뇌졸중 재단(Swedish Stroke Foundation), 스코네(Skåne) 지역, 토르스텐 및 엘사 세게르팔크 재단(Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation), 스웨덴 정부의 전략 연구 분야 이니셔티브(StemTherapy)의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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Cite This Article
Palma-Tortosa, S., Martínez-Curiel, R., Aretio-Medina, C., Avaliani, N., Kokaia, Z. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (190), e64234, doi:10.3791/64234 (2022).