Kvantifiering av immunstained Caspase-9 i retinal vävnad

Summary

Här presenteras ett detaljerat immunhistokemiprotokoll för att identifiera, validera och rikta in sig på funktionellt relevanta caspaser i komplexa vävnader.

Abstract

Familjen av kaspaser är känd för att förmedla många cellulära vägar bortom celldöd, inklusive celldifferentiering, axonal pathfinding och proliferation. Sedan identifieringen av familjen celldödsproteaser har det sökts efter verktyg för att identifiera och utöka funktionen hos specifika familjemedlemmar i utvecklings-, hälso- och sjukdomstillstånd. Många av de för närvarande kommersiellt tillgängliga caspaseverktygen som används i stor utsträckning är dock inte specifika för den riktade caspasen. I denna rapport avgränsar vi det tillvägagångssätt vi har använt för att identifiera, validera och rikta in oss på caspase-9 i nervsystemet med hjälp av en ny hämmare och genetiska metoder med immunohistokemiska avläsningar. Specifikt använde vi retinal neuronal vävnad som en modell för att identifiera och validera närvaron och funktionen av caspaser. Detta tillvägagångssätt möjliggör förhör av celltypspecifika apoptotiska och icke-apoptotiska caspase-9-funktioner och kan tillämpas på andra komplexa vävnader och caspaser av intresse. Att förstå kaspasernas funktioner kan bidra till att utöka nuvarande kunskap inom cellbiologi, och kan också vara fördelaktigt för att identifiera potentiella terapeutiska mål på grund av deras engagemang i sjukdom.

Introduction

Caspaserna är en familj av proteaser som reglerar utvecklingscelldöd, immunsvar och avvikande celldöd vid sjukdom ^1,2. Även om det är välkänt att medlemmar av caspase-familjen induceras i en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, är det mer utmanande att förstå vilken kaspase som driver sjukdomspatologi³. Sådana studier kräver verktyg för att identifiera, karakterisera och validera funktionen hos enskilda caspase-familjemedlemmar. Att analysera de relevanta individuella kaspaserna är viktigt både ur mekanistisk och terapeutisk synvinkel, eftersom litteraturen har flera studier som ger bevis på de olika rollerna hos caspaser ^4,5. Således, om målet är att rikta in sig på en kaspas i en sjukdom för en terapeutisk fördel, är det viktigt att ha specifik inriktning på den relevanta familjemedlemmen / medlemmarna. Traditionella tekniker för att detektera caspasnivåer i vävnad inkluderar western blotting och enzymatiska och fluorometriska metoder ^3,6. Ingen av dessa åtgärder möjliggör dock cellspecifik detektion av kaspasnivåer, och i vissa scenarier kan klyvda kaspaser ofta inte detekteras med traditionella proteinanalysåtgärder. Det är känt att kaspaser kan spela olika apoptotiska och icke-apoptotiska roller i samma vävnad⁷, därför behövs noggrann karakterisering av cellspecifika caspasnivåer för korrekt förståelse av utvecklings- och sjukdomsvägar.

Denna studie visar kaspasaktivering och funktion i en modell av neurovaskulär hypoxi-ischemi – retinal venocklusion (RVO)^7,8. I en komplex vävnad som näthinnan finns det flera celltyper som kan påverkas av hypoxi-ischemi inducerad i RVO, inklusive gliaceller, neuroner och vaskulatur⁷. I den vuxna musens näthinna finns det mycket lite uttryck av caspaser som är uppenbara i frisk vävnad, mätt med immunhistokemi (IHC)⁷, men så är inte fallet under utveckling⁹ eller i modeller av näthinnesjukdom^10,11. IHC är en teknik som är väl etablerad inom biomedicinsk forskning och har möjliggjort validering av sjukdomar och patologiska mål, identifiering av nya roller genom rumslig lokalisering och kvantifiering av proteiner. I de fall där klyvda caspasprodukter inte kan detekteras genom western blot- eller fluorometrisk analys, inte heller den specifika cellplaceringen av distinkta caspaser eller förhör av caspase-signalvägar genom lokalisering, bör IHC användas.

För att bestämma caspase(s) funktionellt relevant i RVO användes IHC med validerade antikroppar för caspaser och cellulära markörer. De tidigare studierna som utförts i labbet visade att caspase-9 snabbt aktiverades i en modell av ischemisk stroke och hämning av caspase-9 med en mycket specifik hämmare skyddad från neuronal dysfunktion och död¹². Eftersom näthinnan är en del av centrala nervsystemet (CNS) fungerar det som ett modellsystem för att fråga och ytterligare undersöka rollen av caspase-9 vid neurovaskulära skador¹³. För detta ändamål användes musmodellen av RVO för att studera den cellspecifika platsen och fördelningen av caspase-9 och dess implikation i neurovaskulär skada. RVO är en vanlig orsak till blindhet hos vuxna i arbetsför ålder som beror på kärlskada¹⁴. Det visade sig att caspase-9 uttrycktes på ett icke-apoptotiskt sätt i endotelceller, men inte i neuroner.

Som vävnad har näthinnan fördelen att den visualiseras som antingen en flatmount, vilket möjliggör uppskattning av kärlnätverken, eller som tvärsnitt, vilket belyser de neuronala retinala skikten. Kvantifiering av caspaseproteinuttryck i tvärsnitt ger sammanhang, angående vilket kaspase som är potentiellt kritiskt i retinal neuronal anslutning och synfunktion genom att identifiera lokaliseringen av caspase (er) i näthinnan. Efter identifiering och validering uppnås inriktning på den kaspas av intresse med hjälp av inducerbar cellspecifik radering av det identifierade caspaset. För potentiella terapeutiska undersökningar testades relevansen av de kaspaser av intresse med hjälp av specifika verktyg för att hämma det aktiverade caspaset. För caspase-9 användes en cell permeant mycket selektiv hämmare ^7,15, Pen1-XBIR3. För denna rapport användes 2 månader gammal, manlig C57BL / 6J-stam och tamoxifeninducerbar endotelkaspas-9 knockout (iEC Casp9KO) stam med en C57BL / 6J-bakgrund. Dessa djur exponerades för musmodellen av RVO och C57BL/6J behandlades med den selektiva caspase-9-hämmaren Pen1-XBir3. Den beskrivna metoden kan tillämpas på andra sjukdomsmodeller i centrala och perifera system ^7,15.

Protocol

Detta protokoll följer Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. Gnagarförsök godkändes och övervakades av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Columbia University. 1. Beredning av näthinnevävnad och kryosektion Avliva djuren genom administrering av intraperitoneal anestesi (ketamin (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg)) och perfusa mössen som utsätts för…

Representative Results

Det beskrivna protokollet tillåter användaren att analysera och kvantifiera caspase-9-nivåer i retinalvävnaden. Dessutom presenterar den verktyg för att ytterligare identifiera, validera och specifikt rikta in sig på caspase-9 och nedströms substrat. De sammanfattade stegen möjliggör kvantifierbar analys av caspasnivåer och cellulär specificitet i fluorescerande fotomikrografer. Alla figurer visar representativa fotomikrografer och kvantifiering av de angivna caspasnivåerna i den totala näthinnan, endotelcel…

Discussion

Kaspaser är en flerledad familj av proteaser som bäst studeras för sina roller i celldöd och inflammation; på senare tid har dock en mängd olika icke-dödsfunktioner avslöjats för vissa familjemedlemmar ^4,5. Mycket av vår förståelse av caspasfunktionen härrör från arbete i cellodling och från inferentiella data från mänsklig sjukdom. Även om det uppskattas att det finns avvikande induktion, aktivering eller inaktivering av kaspaser vid sjukdom, …

Materials

anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20