Quantificação da Caspase-9 Imunocorada em Tecido Retiniano

Summary

Apresenta-se aqui um protocolo imuno-histoquímico detalhado para identificar, validar e direcionar caspases funcionalmente relevantes em tecidos complexos.

Abstract

A família das caspases é conhecida por mediar muitas vias celulares além da morte celular, incluindo diferenciação celular, pathfinding axonal e proliferação. Desde a identificação da família das proteases de morte celular, tem havido uma busca por ferramentas para identificar e expandir a função de membros específicos da família em estados de desenvolvimento, saúde e doença. No entanto, muitas das ferramentas de caspase atualmente disponíveis comercialmente que são amplamente utilizadas não são específicas para a caspase alvo. Neste relato, delineamos a abordagem que usamos para identificar, validar e direcionar a caspase-9 no sistema nervoso usando um novo inibidor e abordagens genéticas com leituras imuno-histoquímicas. Especificamente, utilizamos o tecido neuronal da retina como modelo para identificar e validar a presença e a função das caspases. Essa abordagem permite o interrogatório de funções específicas da caspase-9 apoptóticas e não apoptóticas do tipo celular e pode ser aplicada a outros tecidos complexos e caspases de interesse. Compreender as funções das caspases pode ajudar a expandir o conhecimento atual em biologia celular, e também pode ser vantajoso para identificar potenciais alvos terapêuticos devido ao seu envolvimento na doença.

Introduction

As caspases são uma família de proteases que regulam a morte celular do desenvolvimento, as respostas imunes e a morte celular aberrante na doença ^1,2. Embora seja bem sabido que os membros da família da caspase são induzidos em uma variedade de doenças neurodegenerativas, entender qual caspase impulsiona a patologia da doença é mais desafiador³. Tais estudos requerem ferramentas para identificar, caracterizar e validar a função de membros individuais da família caspase. A análise das caspases individuais relevantes é importante tanto do ponto de vista mecanicista quanto terapêutico, pois a literatura possui múltiplos estudos que fornecem evidências dos diversos papéis das caspases ^4,5. Assim, se o objetivo é direcionar uma caspase em uma doença para um benefício terapêutico, é fundamental ter um direcionamento específico do(s) membro(s) relevante(s) da família. As técnicas tradicionais para detectar os níveis de caspase no tecido incluem western blotting e abordagens enzimáticas e fluorométricas ^3,6. No entanto, nenhuma dessas medidas permite a detecção específica de células dos níveis de caspase e, em alguns cenários, as caspases clivadas muitas vezes não podem ser detectadas pelas medidas tradicionais de análise de proteínas. Sabe-se que as caspases podem desempenhar diferentes papéis apoptóticos e não apoptóticos no mesmo tecido⁷, portanto, é necessária uma caracterização cuidadosa dos níveis de caspase específicos das células para a compreensão precisa das vias de desenvolvimento e da doença.

Este estudo mostra a ativação e a função da caspase em um modelo de hipóxia-isquemia neurovascular – oclusão da veia retiniana (RVO)^7,8. Em um tecido complexo como a retina, existem vários tipos de células que podem ser afetadas pela hipóxia-isquemia induzida no RVO, incluindo células gliais, neurônios e vasculatura⁷. Na retina adulta de camundongos, há muito pouca expressão de caspases evidentes no tecido saudável, medida pela imuno-histoquímica (IHC)⁷, mas esse não é o caso durante o desenvolvimento⁹ ou em modelos de doença retiniana^10,11. A IHC é uma técnica bem estabelecida na pesquisa biomédica e tem permitido a validação de alvos patológicos e patológicos, a identificação de novos papéis por meio da localização espacial e a quantificação de proteínas. Nos casos em que os produtos de caspase clivada não podem ser detectados por western blot ou análise fluorométrica, nem a localização celular específica de caspases distintas ou interrogação de vias de sinalização de caspase através da localização, então o IHC deve ser usado.

Para determinar a(s) caspase(s) funcionalmente relevante na RVO, a IHC foi utilizada com anticorpos validados para caspases e marcadores celulares. Os estudos prévios realizados em laboratório mostraram que a caspase-9 foi rapidamente ativada em um modelo de acidente vascular cerebral isquêmico e inibição da caspase-9 com um inibidor altamente específico protegido da disfunção neuronal e da morte¹². Como a retina faz parte do sistema nervoso central (SNC), ela serve como um sistema modelo para consultar e investigar melhor o papel da caspase-9 em lesões neurovasculares¹³. Para este fim, o modelo de RVO em camundongo foi usado para estudar a localização e distribuição específicas da célula da caspase-9 e sua implicação na lesão neurovascular. A RVO é uma causa comum de cegueira em adultos em idade ativa que resulta de lesão vascular¹⁴. Verificou-se que a caspase-9 foi expressa de forma não apoptótica em células endoteliais, mas não em neurônios.

Como tecido, a retina tem a vantagem de ser visualizada como uma montagem plana, que permite a apreciação das redes vasculares, ou como seções transversais, que destacam as camadas neuronais da retina. A quantificação da expressão da proteína caspase em cortes transversais fornece contexto, em relação ao qual a caspase é potencialmente crítica na conectividade neuronal da retina e na função da visão, identificando a localização da(s) caspase(s) na retina. Após a identificação e validação, o direcionamento da caspase de interesse é alcançado usando a deleção específica de células induzíveis da caspase identificada. Para possíveis investigações terapêuticas, a relevância das caspases de interesse foi testada usando ferramentas específicas para inibir a caspase ativada. Para a caspase-9 uma célula persignificava inibidor altamente seletivo ^7,15, Pen1-XBIR3 foi utilizada. Para este relato, foram utilizadas cepas C57BL/6J masculinas de 2 meses de idade e knockout endotelial induzível por tamoxifeno caspase-9 (iEC Casp9KO) com fundo C57BL/6J. Esses animais foram expostos ao modelo de camundongo de RVO e C57BL/6J foram tratados com o inibidor seletivo da caspase-9, Pen1-XBir3. A metodologia descrita pode ser aplicada a outros modelos de doença nos sistemas central e periférico ^7,15.

Protocol

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia. 1. Preparação do tecido retiniano e criossecção Eutanasiar os animais por meio de anestesia intraperitoneal (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)), e pe…

Representative Results

O protocolo descrito permite ao usuário analisar e quantificar os níveis de caspase-9 no tecido da retina. Além disso, apresenta ferramentas para identificar, validar e direcionar especificamente a caspase-9 e os substratos a jusante. As etapas resumidas permitem a análise quantificável dos níveis de caspase e da especificidade celular em fotomicrografias fluorescentes. Todas as figuras mostram fotomicrografias representativas e quantificação dos níveis de caspase indicados na retina total, células endoteliais …

Discussion

As caspases são uma família de proteases com vários membros melhor estudada por seus papéis na morte celular e inflamação; no entanto, mais recentemente, uma variedade de funções de não-morte tem sido descoberta para alguns membros da família ^4,5. Grande parte da nossa compreensão da função da caspase é derivada do trabalho em cultura de células e de dados inferenciais de doenças humanas. Embora seja apreciado que haja indução, ativação ou ina…

Materials

anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20