सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में प्रॉक्सिमिटी लिगेशन और क्वांटिटेटिव पीसीआर के माध्यम से होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन इंटरमीडिएट्स का पता लगाना
Summary
डी-लूप कैप्चर (डीएलसी) और डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई) परख मात्रात्मक पीसीआर के साथ निकटता बंधाव के सिद्धांत का उपयोग करते हैं ताकि डी-लूप गठन, डी-लूप एक्सटेंशन और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में एक इंड्यूसेबल डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक की साइट पर उत्पाद गठन की मात्रा निर्धारित की जा सके।
Abstract
सेल चक्र के एस और जी 2 चरणों के दौरान डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक और इंटर-स्ट्रैंड क्रॉस-लिंक सहित डीएनए क्षति की मरम्मत समरूप पुनर्संयोजन (एचआर) द्वारा की जा सकती है। इसके अलावा, एचआर रुकावट या पतन के बाद प्रतिकृति फोर्क बचाव के एक महत्वपूर्ण तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इस जटिल मार्ग के कई प्रतिवर्ती और अपरिवर्तनीय चरणों का विनियमन इसकी निष्ठा को बढ़ावा देता है। एचआर के दौरान गठित पुनर्संयोजन मध्यवर्ती का भौतिक विश्लेषण विभिन्न न्यूक्लियोप्रोटीन कारकों और उनके इंटरएक्टर्स द्वारा इन नियंत्रणों के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। यद्यपि पुनर्संयोजन मार्ग में विशिष्ट घटनाओं और मध्यवर्ती की परख करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं, लेकिन डी-लूप गठन और विस्तार का पता लगाना, इस मार्ग में दो महत्वपूर्ण कदम, हाल ही में चुनौतीपूर्ण साबित हुए हैं। यहां, एचआर मार्ग में प्रमुख घटनाओं का पता लगाने के लिए कुशल तरीके, अर्थात् डीएनए डबल-फंसे ब्रेक गठन, डी-लूप गठन, डी-लूप एक्सटेंशन, और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) के माध्यम से उत्पादों का गठन वर्णित है। ये परख उच्च संवेदनशीलता वाले उनके प्रासंगिक पुनर्संयोजन मध्यवर्ती और उत्पादों का पता लगाते हैं और सेलुलर व्यवहार्यता से स्वतंत्र होते हैं। डी-लूप, डी-लूप एक्सटेंशन और बीआईआर उत्पाद का पता लगाना निकटता बंधाव पर आधारित है। साथ में, ये परख जनसंख्या स्तर पर एचआर के कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ताकि मार्ग में महत्वपूर्ण चरणों में एचआर प्रोटीन और नियामकों के कार्यों को बारीकी से संबोधित किया जा सके।
Introduction
होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन (एचआर) डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी), इंटर-स्ट्रैंड क्रॉस-लिंक और एसएसडीएनए अंतराल की मरम्मत के साथ-साथ डीएनए क्षति सहिष्णुता के लिए एक मार्ग का एक उच्च-निष्ठा तंत्र है। एचआर डीएनए क्षति की मरम्मत / सहिष्णुता के लिए त्रुटि-प्रवण मार्गों से भिन्न होता है, जैसे कि गैर-होमोलोगस एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे) और ट्रांसलेशन संश्लेषण, जिसमें यह मरम्मत की घटना को टेम्पलेट करने के लिए दाता के रूप में एक बरकरार, समरूप डुप्लेक्स डीएनए का उपयोग करता है। इसके अलावा, एचआर मार्ग में कई प्रमुख मध्यवर्ती प्रतिवर्ती हैं, जिससे व्यक्तिगत मार्ग चरणों के उत्तम विनियमन की अनुमति मिलती है। सेल चक्र के एस, जी 2 और एम चरणों के दौरान, एचआर दो-अंत डीएसबी1 की मरम्मत के लिए एनएचईजे के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। इसके अलावा, प्रतिकृति से जुड़े डीएनए क्षति की मरम्मत के लिए डीएनए प्रतिकृति के लिए एचआर आवश्यक है, जिसमें एसएसडीएनए अंतराल और एक तरफा डीएसबी शामिल हैं, और डीएनए घाव बाईपास2 के तंत्र के रूप में।
मानव संसाधन मार्ग में एक महत्वपूर्ण मध्यवर्ती विस्थापन लूप, या डी-लूप (चित्रा 1) है। अंत शोधन के बाद, प्रतिक्रिया में केंद्रीय रिकोम्बिनेस, Rad51, टूटे हुए अणु के नए कटे हुए एसएसडीएनए पर लोड होता है, जिससे एक पेचदार फिलामेंट2 बनता है। Rad51 तब एक उपयुक्त समरूप दाता की पहचान करने के लिए एक होमोलॉजी खोज करता है, आमतौर पर दैहिक कोशिकाओं में बहन क्रोमैटिड। डी-लूप तब बनता है जब रैड 51-एसएसडीएनए फिलामेंट एक समरूप डुप्लेक्स डीएनए पर आक्रमण करता है, जो दाता के पूरक स्ट्रैंड के साथ टूटे हुए स्ट्रैंड के वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग की ओर जाता है, जो विपरीत दाता स्ट्रैंड को विस्थापित करता है। डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा टूटे हुए स्ट्रैंड के 3 ‘छोर का विस्तार डीएनए क्षति घटना के दौरान खो गए आधारों को बदल देता है और संश्लेषण-निर्भर स्ट्रैंड एनीलिंग (एसडीएसए), डबल-हॉलिडे जंक्शन (डीएचजे), या ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) एचआर उप-मार्गों के माध्यम से डीएसडीएनए उत्पाद में विस्तारित डी-लूप मध्यवर्ती के संकल्प को बढ़ावा देता है।
मानव संसाधन मार्ग में मध्यवर्ती की शारीरिक रूप से निगरानी करने वाले परख प्रत्येक चरण (यानी, मार्ग विश्लेषण) के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के विश्लेषण की अनुमति देते हैं। डीएसबी गठन, अंत शोधन, डीएचजे, बीआईआर प्रतिकृति बुलबुले, और मानव संसाधन उत्पादों को दक्षिणीसोख्ता 3,4,5,6,7 द्वारा आसानी से देखा जाता है। फिर भी, दक्षिणी सोख्ता नवजात और विस्तारित डी-लूप पर रिपोर्ट करने में विफल रहता है, और, इस प्रकार, इन संयुक्त अणुओं को मज़बूती से मापने के लिए एक वैकल्पिक विधि की आवश्यकता होती है 4,8,9। नवजात डी-लूप गठन का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली रणनीति रैड 51 के क्रोमैटिन-इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) 10,11 के साथ युग्मित है। हालांकि, सीएचआईपी-क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया डीएसडीएनए के साथ Rad51 संबंध अनुक्रम होमोलॉजी और Rad51 एक्सेसरी फैक्टर Rad5410,11 से स्वतंत्र है। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत डी-लूप विश्लेषण की विधि का उपयोग करके एक सराहनीय संकेत, जिसे डी-लूप कैप्चर (डीएलसी) परख कहा जाता है, डीएसबी गठन, अनुक्रम होमोलॉजी, रैड 51 और रैड 51 सहायक प्रोटीन Rad52 और Rad548 पर निर्भर करता है। यह खोज कि सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया रैड 51-प्रवर्तित डी-लूप गठन विवो में Rad54 पर निर्भर करता है, कई इन विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों के साथ सहमति में है जो दर्शाता है कि नवोदित खमीर Rad51 8,12,13,14,15 द्वारा होमोलॉजी खोज और डी-लूप गठन के लिए Rad54 की आवश्यकता है।
डी-लूप एक्सटेंशन को मापने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण, मुख्य रूप से अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से, इसी तरह समस्याग्रस्त हैं। डी-लूप विस्तार का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट पीसीआर-आधारित परख एक अद्वितीय अनुक्रम को बढ़ाती है, जिसके परिणामस्वरूप ब्रेक साइट और एक अस्थानिक दाता के बीच पुनर्संयोजन और बाद में पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण, टूटे हुए स्ट्रैंड पर होमोलॉजी के क्षेत्र के प्राइमर अपस्ट्रीम और दाता स्ट्रैंड पर होमोलॉजी के क्षेत्र के एक अन्य प्राइमर डाउनस्ट्रीम के माध्यम से होता है। इस विधि का उपयोग करके, पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण का पता लगाने के लिए गैर-आवश्यक पोल δ प्रक्रिया कारक पोल 3216 की आवश्यकता होती है। यह खोज इस अवलोकन के साथ संघर्ष करती है कि पीओएल 32 विलोपन का विवो17 में जीन रूपांतरण पर केवल हल्का प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, ये पीसीआर-आधारित परख अस्थायी रूप से डी-लूप एक्सटेंशन और बीआईआर उत्पाद गठन को हल करने में विफल रहते हैं, यह सुझाव देते हुए कि सिग्नल एसएसडीएनए मध्यवर्ती 17,18,19 के बजाय डीएसडीएनए उत्पादों से उत्पन्न होता है। डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई) परख हाल ही में इन विसंगतियों को दूर करने के लिए विकसित की गई थी। डीएलई परख प्रारंभिक 3 ‘हमलावर अंत9 के डाउनस्ट्रीम ~ 400 बेस जोड़े (बीपी) साइट पर पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण को निर्धारित करता है। इस विधि से, डी-लूप एक्सटेंशन पोल 32 से स्वतंत्र है और डीएसबी प्रेरण के बाद 4 घंटे के भीतर पता लगाने योग्य है, जबकि बीआईआर उत्पादों को पहली बार 6 घंटे पर देखा जाता है। दरअसल, हैबर और माल्कोवा प्रयोगशालाओं के एक हालिया प्रकाशन ने नोट किया कि जीनोमिक डीएनए की तैयारी की इस विधि का उपयोग करने से एसएसडीएनए संरक्षण 9,20 होता है।
यहां, डीएलसी और डीएलई परख विस्तार से वर्णित हैं। ये परख एस सेरेविसिया (चित्रा 2)8,9 में नवजात और विस्तारित डी-लूप का पता लगाने के लिए निकटता बंधाव पर भरोसा करते हैं। बीआईआर उत्पादों को इसी परख प्रणाली का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। दोनों परखों के लिए, क्रोमोसोम (सीएचआर) वी पर यूआरए 3 लोकस में स्थित एचओ एंडोन्यूक्लिज़ कट साइट पर डीएसबी गठन एक गैलेक्टोज-इंड्यूसेबल प्रमोटर के नियंत्रण में एचओ एंडोन्यूक्लिज़ की अभिव्यक्ति से प्रेरित होता है। Rad51-मध्यस्थता डीएनए स्ट्रैंड आक्रमण से CHR II पर LYS2 लोकस में स्थित एक अस्थानिक दाता की साइट पर नवजात डी-लूप गठन होता है। चूंकि डीएसबी के दाईं ओर दाता के लिए होमोलॉजी का अभाव है, एसडीएसए और डीएचजे गठन के माध्यम से मरम्मत संभव नहीं है। बीआईआर द्वारा डीएसबी की प्रारंभिक मरम्मत संभव है, लेकिन व्यवहार्य उत्पादों का गठन सेंट्रोमियर21 की उपस्थिति से बाधित होता है। यह जानबूझकर डिजाइन उत्पादक डीएसबी मरम्मत को रोकता है, जिससे मरम्मत किए गए डीबीएस के साथ कोशिकाओं द्वारा विकास को फिर से शुरू करने से बचा जा सकता है, जो अन्यथा समय पाठ्यक्रम विश्लेषण के दौरान संस्कृति से आगे निकल सकता है।
डीएलसी परख में, डी-लूप के भीतर हेटरोडुप्लेक्स डीएनए के दो किस्में की सोरालेन क्रॉसलिंकिंग पुनर्संयोजन मध्यवर्ती को संरक्षित करती है। टूटे हुए (कटे हुए) स्ट्रैंड और पाचन पर प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली के बाद, क्रॉसलिंकिंग समरूप टूटे हुए और दाता डीएनए के ऊपर अद्वितीय अनुक्रमों के बंधाव की अनुमति देता है। क्यूपीसीआर का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने में मौजूद चिमेरिक डीएनए अणु का स्तर निर्धारित किया जाता है। डीएलई परख में, क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता नहीं होती है, और प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली और पाचन के बाद इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन इसके बजाय टूटे हुए अणु के 5 ‘छोर को नए विस्तारित 3 ‘ अंत से जोड़ता है। फिर, क्यूपीसीआर का उपयोग प्रत्येक नमूने में इस चिमेरिक उत्पाद की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली की अनुपस्थिति में, डीएलई परख डी-लूप विस्तार के बाद बनने वाले बीआईआर (डीएसडीएनए) उत्पाद के सापेक्ष स्तरों पर रिपोर्ट करता है।
जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग करके प्रत्येक परख के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं, और पाठकों को पुनर्संयोजन उत्परिवर्ती 8,9 के विश्लेषण के लिए इन परखों के उपयोग के लिए पियाज़ा एटअल.8 और पियाज़ा एट अल.9 को संदर्भित किया जाता है। इस योगदान का उद्देश्य अन्य प्रयोगशालाओं को डीएलसी और डीएलई परख को अपनाने में सक्षम बनाना है, और अनुरोध पर उनके लिए समर्थन उपलब्ध है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत परख निकटता बंधाव और क्यूपीसीआर का उपयोग करके नवजात और विस्तारित डी-लूप (डीएलसी परख), डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई परख), और बीआईआर उत्पाद गठन (बिना हाइब्रिडिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ डीएलई पर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हेयर प्रयोगशाला में काम को डब्ल्यू-डीएच को जीएम 58015 और जीएम 137751 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। पियाज़ा प्रयोगशाला में अनुसंधान यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-एसटीजी 3 डी-लूप, ग्रैंड एग्रीमेंट 851006) द्वारा समर्थित है। डी.आर. को T32CA108459 और A.P. Gianni फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है। हम शिह-सुन हंग (हेयर लैब) को अपने डीएलसी / डीएलई परख परिणामों को साझा करने और इस प्रोटोकॉल में विस्तृत परख में परिवर्तनों को भी मान्य करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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