사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출
Summary
D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.
Abstract
세포주기의 S 및 G2 단계에서 발생하는 DNA 이중 가닥 절단 및 가닥 간 교차 결합을 포함한 DNA 손상은 상동 재조합 (HR)에 의해 복구 될 수 있습니다. 또한 HR은 정지 또는 붕괴 후 복제 포크 구조의 중요한 메커니즘을 나타냅니다. 이 복잡한 경로의 많은 가역적 및 비가역적 단계의 조절은 충실도를 촉진합니다. HR 중에 형성된 재조합 중간체의 물리적 분석은 다양한 핵 단백질 인자 및 그 상호 작용자에 의한 이러한 제어의 특성화를 가능하게합니다. 재조합 경로에서 특정 사건과 중간체를 분석하는 잘 확립된 방법이 있지만, 이 경로의 두 가지 중요한 단계인 D-루프 형성 및 확장의 검출은 최근까지 어려운 것으로 판명되었습니다. 여기에서는 HR 경로에서 주요 사건, 즉 DNA 이중 가닥 절단 형성, D-루프 형성, D-루프 확장 및 사카로마이세스 세레비시아에서 절단 유도 복제(BIR)를 통한 생성물 형성을 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 관련 재조합 중간체 및 고감도의 생성물을 검출하며 세포 생존력과 무관합니다. D-루프, D-루프 확장 및 BIR 제품의 검출은 근접 결찰을 기반으로 합니다. 함께, 이러한 분석은 인구 수준에서 HR의 동역학을 연구하여 경로의 중요한 단계에서 HR 단백질 및 조절자의 기능을 미세하게 다룰 수 있습니다.
Introduction
상동 재조합(HR)은 DNA 이중 가닥 절단(DSB), 가닥 간 교차 링크 및 ssDNA 갭의 복구에 대한 고충실도 메커니즘이자 DNA 손상 내성 경로입니다. HR은 손상되지 않은 상동 말단 접합(NHEJ) 및 전이 합성과 같은 DNA 손상 복구/내성에 대한 오류가 발생하기 쉬운 경로와 다르며, 손상되지 않은 상동 이중 DNA를 기증자로 사용하여 복구 이벤트를 주형화합니다. 또한 HR 경로의 많은 주요 중간체는 가역적이므로 개별 경로 단계를 정교하게 조절할 수 있습니다. 세포 주기의 S, G2 및 M 단계 동안 HR은 2단DSB1의 수리를 위해 NHEJ와 경쟁합니다. 또한, HR은 ssDNA 갭 및 일방적 DSB를 포함한 복제 관련 DNA 손상의 복구를 위한 DNA 복제에 필수적이며, DNA병변 우회의 메커니즘으로서 2.
HR 경로의 중요한 중간은 변위 루프 또는 D 루프입니다(그림 1). 말단 절제술 후, 반응의 중심 재조합 효소 인 Rad51은 부서진 분자의 새로 절제 된 ssDNA에로드되어 나선형 필라멘트2를 형성합니다. 그런 다음 Rad51은 적절한 상동 공여체, 일반적으로 체세포에서 자매 염색분체를 확인하기 위해 상동성 검색을 수행합니다. D- 루프는 Rad51-ssDNA 필라멘트가 상동 이중 DNA를 침범 할 때 형성되며, 이는 부러진 가닥과 기증자의 상보적인 가닥의 Watson-Crick 염기 쌍으로 이어져 반대쪽 기증자 가닥을 대체합니다. DNA 중합효소에 의한 파손된 가닥의 3′ 말단의 확장은 DNA 손상 이벤트 동안 손실된 염기를 대체하고 합성 의존성 가닥 어닐링(SDSA), 이중 할러데이 접합(dHJ) 또는 파손 유도 복제(BIR) HR 하위 경로를 통해 확장된 D-루프 중간체의 dsDNA 생성물로의 분해를 촉진합니다.
HR 경로에서 중간체를 물리적으로 모니터링하는 분석은 각 단계에 대한 유전 적 요구 사항의 분석 (즉, 경로 분석)을 허용합니다. DSB 형성, 말단 절제술, dHJ, BIR 복제 버블 및 HR 생성물은 서던 블로팅 3,4,5,6,7에 의해 쉽게 관찰된다. 그러나 서던 블로팅은 초기 및 확장 D-루프에 대해 보고하지 못하므로 이러한 관절 분자를 안정적으로 측정하기 위한 대체방법이 필요합니다4,8,9. 초기 D-루프 형성을 분석하기 위해 널리 사용되는 전략 중 하나는 정량적 PCR(qPCR)10,11과 결합된 Rad51의 염색질 면역침전(ChIP)입니다. 그러나, ChIP-qPCR에 의해 측정된 dsDNA와의 Rad51 연관성은 서열 상동성 및 Rad51 부속 인자Rad54 10,11과 무관하다. 대조적으로, D-루프 캡처(DLC) 분석이라고 하는 여기에 제시된 D-루프 분석 방법을 사용하는 상당한 신호는 DSB 형성, 서열 상동성, Rad51 및 Rad51 부속 단백질 Rad52 및 Rad548에 따라 달라집니다. 사카로마이세스 세레비시아에 Rad51-촉진된 D-루프 형성이 생체내 Rad54에 의존한다는 발견은 Rad54가 출아 효모 Rad51에 의한 상동성 검색 및 D-루프 형성에 필요하다는 것을 나타내는 수많은 시험관내 재구성 실험 8,12,13,14,15와 일치한다.
주로 반정량적 PCR을 통해 D-루프 확장을 측정하는 현재의 접근 방식도 마찬가지로 문제가 있습니다. D-루프 확장을 검출하기 위한 전형적인 PCR 기반 분석은 끊어진 가닥에 대한 상동성 영역의 상류에 있는 프라이머와 공여자 가닥에 대한 상동성 영역의 또 다른 프라이머 하류를 통해 절단 부위와 이소성 공여체 사이의 재조합 및 후속 재조합 관련 DNA 합성으로 인한 고유한 서열을 증폭합니다. 이 방법을 사용하여, 재조합 관련 DNA 합성의 검출은 필수적이지 않은 Pol δ 공정성 인자 Pol3216을 필요로 한다. 이 발견은 POL32 결실이 생체 내유전자 전환에 경미한 효과 만 갖는다는 관찰과 충돌합니다. 더욱이, 이러한 PCR 기반 분석은 D- 루프 확장 및 BIR 생성물 형성을 일시적으로 해결하지 못하며, 이는 신호가 ssDNA 중간체17,18,19가 아닌 dsDNA 산물에서 발생한다는 것을 시사한다. D-루프 확장(DLE) 분석은 이러한 불일치를 해결하기 위해 최근에 개발되었습니다. DLE 분석은 초기 3′ 침범 말단9의 하류에 ~400 염기쌍(bp) 부위에서 재조합 관련 DNA 합성을 정량화합니다. 이 방법에 의해, D-루프 확장은 Pol32와 독립적이며 DSB 유도 후 4시간 이내에 검출될 수 있는 반면, BIR 생성물은 6h에서 처음 관찰된다. 실제로 Haber 및 Malkova 실험실의 최근 간행물에 따르면 이 게놈 DNA 준비 방법을 사용하면 ssDNA 보존 9,20이 발생합니다.
여기서, DLC 및 DLE 분석이 상세히 설명된다. 이러한 분석은 근접 결찰에 의존하여 S. cerevisiae에서 초기 및 확장 D- 루프를 감지합니다 (그림 2)8,9. BIR 제품은 이와 동일한 분석 시스템을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 두 검정 모두에서, 염색체 상의 URA3 유전자좌 (Chr.) V에 위치한 HO 엔도뉴클레아제 절단 부위에서의 DSB 형성은 갈락토스-유도성 프로모터의 조절하에 HO 엔도뉴클레아제의 발현에 의해 유도된다. Rad51 매개 DNA 가닥 침습은 Chr. II의 LYS2 유전자좌에 위치한 이소성 기증자 부위에서 초기 D- 루프 형성을 유도합니다. DSB의 오른쪽은 기증자와의 상동성이 부족하기 때문에 SDSA 및 dHJ 형성을 통한 복구가 불가능합니다. BIR에 의한 DSB의 초기 수리는 가능하지만, 생존 가능한 생성물의 형성은 중심체(21)의 존재에 의해 억제된다. 이러한 의도적인 설계는 생산적인 DSB 복구를 방지하여 시간 경과 분석 중에 배양을 추월할 수 있는 복구된 DBS가 있는 세포에 의한 성장 재개를 방지합니다.
DLC 분석에서, D- 루프 내의 헤테로 듀플렉스 DNA의 두 가닥의 소 랄렌 가교는 재조합 중간체를 보존한다. 파손된(절제된) 가닥 및 소화에 대한 제한 효소 부위 복원 후, 가교결합은 상동 파괴 및 공여자 DNA의 상류에서 고유한 서열의 결찰을 허용합니다. qPCR을 사용하여 각 샘플에 존재하는 키메라 DNA 분자의 수준을 정량화합니다. DLE 분석에서, 가교결합은 필요하지 않으며, 제한 효소 부위 복원 및 소화에 이어 분자내 결찰은 대신 부서진 분자의 5′ 말단을 새로 확장된 3′ 말단에 연결시킨다. 다시 말하지만, qPCR은 각 샘플에서 이 키메라 산물의 상대적인 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 제한 효소 부위 복원이 없는 경우, DLE 분석은 D-루프 확장 후 형성되는 BIR(dsDNA) 생성물의 상대적 수준에 대해 보고합니다.
야생형 균주를 사용한 각각의 분석에 대한 대표적인 결과가 도시되어 있으며, 독자는 재조합 돌연변이체 8,9의 분석을 위한 이들 분석의 사용에 대해 Piazza et al.8 및 Piazza et al.9에 참조된다. 이 기여의 목적은 다른 실험실에서 DLC 및 DLE 분석을 채택할 수 있도록 하는 것이며 요청 시 지원이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 분석은 근접 결찰 및 qPCR을 사용하여 초기 및 확장 D-루프(DLC 분석), D-루프 확장(DLE 분석) 및 BIR 생성물 형성(혼성화 올리고뉴클레오티드가 없는 DLE 분석)의 검출을 허용합니다. DSB로부터 멀리 떨어진 부위에 대한 Rad51의 ChIP-qPCR은 이전에 Rad51 매개 상동성 검색 및 D 루프 형성을 위한 프록시로서 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 ChIP-qPCR 신호는 Rad51-관련 인자 Rad54뿐만 아니라 중단 부위와 잠재?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Heyer 실험실에서의 연구는 W.-D.H.에 GM58015 및 GM137751 보조금으로 지원됩니다. Piazza 실험실의 연구는 유럽 연구위원회 (ERC-StG 3D-loop, 그랜드 컨디먼트 851006)의 지원을받습니다. D.R.은 T32CA108459와 A.P. Giannini Foundation의 지원을 받습니다. DLC/DLE 분석 결과를 공유하고 이 프로토콜에 자세히 설명된 분석의 변경 사항을 추가로 검증해 주신 Shih-Hsun Hung(Heyer Lab)에게 감사드립니다.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
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